氟尿苷二乙酸酯脂质固体纳米粒的制备
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作者：连佳芳，张三奇，顾宜，石小鹏，奚苗苗 【关键词】 固体
Preparation of floxuridine diacetate solid lipid nanoparticles
【Abstract】 AIM: To prepare floxuridine diacetate solid lipid nanoparticles (FUDRASLN) so as to improve the treatment efficacy and reduce the side effects of floxuridine (FUDR). METHODS: FUDR was esterified with acetic anhydride in the presence of pyridine and 4dimethylaminopyridine. The structure of expected compound, floxuridine diacetate (FUDRA)，was identified by proton nuclear magnetic resonance. The stability of FUDRA in mouse serum and tissue homogenates and octanolbuffer partition coeffient of FUDRA were investigated by reversed phase high performance liquid chromatography (RPHPLC). FUDRA was used to prepare FUDRASLN by dry membrane technique. Transmission electron microscopy was employed to study the shape and particle diameter distribution of FUDRASLN. Drug loading and entrapment efficiency were also determined by RPHPLC. RESULTS: FUDRA was more stable in weak acid solution than in base solution, hydrolyzed fast in serum and tissue homogenates, especially in liver homogenate. The partition coefficient of FUDRA was 58.13. The diameter distribution of FUDRASLN was （208±53） nm, drug loading was 7.63% and entrapment efficiency was 94.21%. CONCLUSION: The lipophilicity of FUDR is dramatically increased after esterification with acetic anhydride. FUDRASLN has a high entrapment efficiency and a good distribution in size.
【Keywords】 floxuridine; solid lipid nanoparticles; targeted drug delivery system
【摘要】 目的：为了提高氟尿苷（FUDR）的疗效，降低其毒副作用而制备氟尿苷二乙酸酯固体脂质纳米粒（FUDRASLN）. 方法：在吡啶和4二甲氨基吡啶存在时，FUDR与乙酸酐反应，制备氟尿苷二乙酸酯，并测定其核磁共振氢谱.RPHPLC测定其在正辛醇和磷酸盐缓冲液中的分配系数及不同pH缓冲液和组织匀浆中的稳定性.采用薄膜分散法制备FUDRASLN；透射电镜研究其形态、粒径及粒径分布；RPHPLC测定载药量、包封率. 结果：制备成的FUDRA在弱酸性溶液中较稳定，在弱碱性溶液中水解较快；在血清和组织匀浆中易水解，在肝匀浆中水解最快；FUDRA分配系数为58.13. FUDRASLN粒径为（208±53）nm，载药量为7.63％，包封率为94.21％. 结论: FUDR转化成FUDRA后亲脂性大大增加；FUDRASLN包封率较高，粒径分布较均匀.
0引言
氟尿苷(floxuridine, FUDR)是5氟尿嘧啶（5FU）的脱氧核苷衍生物，是有效的抗代谢类抗消化道肿瘤新药，主要用于肝癌治疗. 为了增加其肝靶向性，我们制备了氟尿苷固体脂质纳米粒（FUDRSLN），但FUDR的脂溶性较小，制备固体脂质纳米粒（solid lipid nanoparticles, SLN）比较困难，故将FUDR酯化，合成了氟尿苷二乙酸酯(FUDRA)，以大豆磷脂为药物载体，制备FUDRASLN，期望药物静注后可浓集于肝脏，达到提高疗效，降低毒副作用的目的.
1材料和方法
1.1材料
RE52旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；UV265型紫外可见分光光度计（日本岛津）；INOVA400超导核磁共振仪（美国Varian）；LC10Avp高效液相色谱仪（日本岛津）；色谱柱：Kromasil C18柱，5 μm，4.6 mm×150.0 mm；KQ250型超声波发生器(江苏昆山淀山湖检测仪器厂)，BP190S电子天平(德国赛多利斯)，XW80A漩涡混合器（江苏海门市麒麟医用仪器厂）；JEM2000Ex型透射电子显微镜（日本电子）；TG16W微量高速离心机（湖南仪器仪表总厂光华仪器厂）；Sephadex G50葡聚糖凝胶（华美生物工程公司）. 药品和试剂：FUDR（浙江海正药业股份有限公司，批号041202，纯度99.2％）；乙酸酐（开封化学试剂总厂，批号001022）；大豆磷脂（注射用，上海太伟药业有限公司，批号040716）. 其他药品和试剂均为分析纯. 昆明种小鼠5只，体质量(20±2) g, 由第四军医大学实验动物中心提供.
1.2方法
1.2.1FUDRA的合成及结构鉴定FUDR 0.25 g，加入干燥的二氯甲烷30 mL中，依次加入乙酸酐0.31 g，吡啶3 mL，催化量4二甲氨基吡啶. 反应混合物室温搅拌3 h，反应结束后加入250 mL乙酸乙酯，依次用稀HCl，稀NaHCO3和H2O洗涤，加入适量无水Na2SO4干燥2 h，过滤，滤液旋转蒸发，除去大部分乙酸乙酯，加入石油醚使产物结晶析出，抽滤，干燥. 合成路线如图1所示. 进行核磁共振氢谱(1HNMR)鉴定.
1.2.2FUDRA稳定性考察反相高效液相色谱法(RPHPLC)测定FUDRA的含量. 流动相∶甲醇水(35∶75)；流速：1 mL/min；检测波长：268 nm；保留时间：(5.5±0.1) min；温度：25℃. 配制FUDRA系列浓度标准液，分别进样20 μL，以峰面积（A）对浓度（c）进行线性回归，在0.5～100.0 mg/L范围内有良好的线性关系，回归方程为A=-454.22+33317c，相关系数r=0.9999，P<0.05(n=5). 高、中、低三种浓度的平均回收率为102.4% (RSD=2.21%). 精密吸取FUDRA(8.75 mg/L)甲醇液1 mL，加到9 mL 37℃水浴预热的pH分别为4.5,6.8, 7.4,7.8的缓冲液中,混漩振荡1 min后,置入37℃水浴中,于不同时间点取样20 μL进样，测定残留FUDRA浓度. 以浓度的自然对数对时间进行线性回归，求反应速率常数和FUDRA水解半衰期. 为评价FUDRA在体内转化为FUDR的速度，进行了FUDRA在小鼠血清及不同组织匀浆中的水解动力学研究. 小鼠眼眶取血后处死，迅速取出肝、肾、肺组织. 血浆离心10 min（14 000 g），取上清液0.5 mL加pH 6.8的缓冲液4.0 mL；肝、肾、肺组织称质量，加五倍量pH 6.8的缓冲液,匀浆，离心10 min（14 000 g），取上清液1.0 mL，加pH 6.8的缓冲液4.0 mL，混匀. 向37℃水浴中预热的血清及组织匀浆稀释液中加入FUDRA贮备液（87 mg/L）各1.0 mL，漩涡混合1 min，于不同时间取样200 μL，加甲醇500 μL，混合1 min，离心5 min（14 000 g），取上清液20 μL进样，测定残留药物浓度. 以浓度的自然对数对时间进行线性回归，求FUDRA水解速率常数和半衰期.
1.2.3FUDRA分配系数(P)的测定精密量取FUDRA的正辛醇溶液（84 mg/L） 5 mL，加入用正辛醇饱和过的磷酸盐缓冲液（pH 6.8） 5 mL, 混合5 min,HPLC法测定两相FUDRA浓度；用正辛醇饱和过的磷酸盐缓冲液（pH 6.8）配制FUDR溶液（120 mg/L），精密量取该液5 mL，加入正辛醇5 mL, 混合5 min,RPHPLC法测定两相中FUDR浓度. P=C醇/C水,C醇表示在正辛醇中的浓度,C水表示在水中的浓度.
1.2.4FUDRASLN的制备在单因素考察的前提下，利用薄膜超声分散法通过均匀设计优化制备工艺. 精密称取FUDRA 10 mg，大豆磷脂90 mg于100 mL圆底烧瓶中，加入15 mL氯仿溶解. 旋转蒸发除去氯仿，在烧瓶壁上形成一层薄膜. 加入60 g/L甘露醇水溶液10.0 mL，水浴超声两次，每次30 min，分装于安瓿中.
1.2.5FUDRASLN的形态学研究取FUDRASLN胶体溶液适量，加适量水稀释，滴加在铜网上，用20 g/L的磷钨酸钠液染色，用JEM2000Ex型透射电子显微镜观察并拍照，统计100个纳米粒的粒径.
1.2.6FUDRASLN的包封率和载药量的测定采用凝胶层析法. 精密量取FUDRASLN胶体溶液0.5 mL上柱，洗脱液为蒸馏水，每3.0 mL收集一次，流速为0.5 mL/min，层析温度为室温. HPLC法测定固体脂质纳米粒中药物含量. 另取0.5 mL FUDRASLN胶体溶液，置50 mL的容量瓶中，甲醇溶解，定容. HPLC法测FUDRA浓度C0. 包封率=（C透／C0）×100%，载药量=（包封的FUDRA质量／纳米粒总质量）×100%.
统计学处理： 考察时间与Ln(C/C0×100)之间的线性关系，用SPSS 11.0对数据进行相关分析，计算Pearson相关系数r，检验水准α=0.05.
2结果
得片状结晶0.30 g，产率91％，mp 177.0～179.0 ℃. 1HNMR（400 MHz，CDCl3） δ=9.35(s,1H,NH)；7.66(d,1H,C6H)；6.31(t,1H,C1′H)；5.22(m,1H,C3′H)；4.42(m,1H,C4′H)；4.29(m,2H,C5′H)；2.53(m,1H,C2′H)；2.18(m,1H,C2′H)；2.15(s,3H,CH3CO)；2.12(s,3H,CH3CO).
2.1FUDRA在不同pH缓冲液中的稳定性pH对FUDRA稳定性影响较大. FUDRA在弱酸性溶液中较稳定，在弱碱性溶液中水解较快. 由相关系数r可见，水解为表观一级反应（表1）.表1氟尿苷二乙酸酯在不同pH缓冲溶液中的一级水解常数(Kobs)和半衰期(略)
2.2FUDRA在小鼠血清和不同组织匀浆中的稳定性经HPLC检测,FUDRA在血清和组织匀浆中水解成FUDR. 由相关系数r可见，水解为表观一级反应（表2）. 血清和组织匀浆中的酶可显著地加速前体药物的水解，特别是在肝匀浆中.表2不同浓度组织匀浆和缓冲溶液中氟尿苷二乙酸酯的一级水解常数(Kobs)和半衰期(略)
2.3FUDRA的分配系数FUDRA和FUDR的分配系数分别为58.13和0.24，说明FUDR转化成FUDRA后亲脂性大大增加.
2.4FUDRASLN的载药量、包封率和形态HPLC法测得FUDRASLN的载药量为7.63%,包封率为94.21%. FUDRASLN为略带淡蓝色的胶体溶液，透射电镜下可见许多圆形或椭圆形的球粒（图2）. 纳米粒的粒径（208±53）nm.
3讨论
SLN是近年正在发展的一种新型纳米粒类给药系统. 它以固态天然或合成的类脂如卵磷脂、甘油三酯等为载体，将药物包裹或夹嵌于类脂核中，制成固体胶粒给药系统［1］. SLN的制备方法主要有高压乳匀法、乳化分散法、溶剂乳化法、薄膜超声分散法等. 高压乳匀法、乳化分散法等需要加热到一定的温度，对FUDRA的稳定性有影响. 薄膜超声分散法简便易行，适合于实验室制备.
SLN主要适合于包封亲脂性药物［2］. 将含有羟基的水溶性药物酯化制成亲脂性前体药物，可以提高其包封率［3］. FUDR的亲水性较强，与乙酸酐反应转化为FUDRA后，脂溶性明显提高，此反应操作简便，产物易分离纯化. 大豆磷脂毒性低于合成材料，体内可降解且有良好生理相容性［4］，故选其作为药物载体. 在选择SLN分散介质时，曾使用磷酸盐缓冲液和蒸馏水. 用磷酸盐缓冲液作分散介质的SLN在1 d内即很快混浊、分层，表明药物大量泄露，磷脂凝聚. 这是因为电解质的加入减小了体系中各种粒子间的静电排斥作用，促进了脂质载体晶型的转变［5］. 蒸馏水的渗透压太小，用蒸馏水作分散介质的SLN在3 wk后也混浊、分层. 实验证明60 g/L甘露醇水溶液作分散介质的SLN室温放置3 mo也无混浊现象.
FUDRA在不同pH缓冲液中的稳定性研究表明，pH对FUDRA稳定性影响较大，pH 4.5时t1/2为11.18 h，而pH 7.4时t1/2为6.30 h. 由相关系数r可见，水解为表观一级反应. FUDRA在血清和组织匀浆中的降解动力学研究表明，FUDRA在体内很快被脏器中的酯酶水解为FUDR，由此推测FUDRASLN被细胞吞噬后，会迅速水解为FUDR而发挥治疗作用.
文献［6］报道小于7 μm的微粒静注后，由于单核巨嗜细胞系统（MPS）的吞噬作用大部分被摄入肝脾. 本实验我们所制成的FUDRASLN粒径在此范围内，理论上推测具有肝靶向性. 小鼠体内的分布研究正在进行. 我们以前进行过十六酸拉米夫定酯固体脂质纳米粒（LAPSLN）的研究［3，7］，结果表明LAPSLN具有较高的载药量和包封率，肝靶向性良好，据此从实践角度推测FUDRASLN具有肝靶向性.
【参考文献】
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［6］ Yuda T, Maruyama K, Iwatsuru M. Prolongation of liposome circulation time by various derivatives of polyethyleneglycols［J］.Biol Pharm Bull,1996,19(10):1347-1351.
［7］ 薛克昌，张三奇，顾宜，等.十六酸拉米夫定酯固体脂质纳米粒的肝靶向研究［J］.药学学报，2004,20（1）：1-4.