齐墩果酸固体脂质纳米粒的制备与质量评价
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Preparation and quality evaluation of oleanolic acidloaded solid lipid nanoparticles
【Abstract】 AIM: To prepare the oleanolic acidloaded solid lipid nanoparticles (OASLN), determine the content of oleanolic acid in OASLN, and evaluate its quality. METHODS: OASLN were prepared by filmultrasound dispersion technique. The encapsulation efficiency and appearance of solid lipid nanoparticles were studied. RESULTS： The appearance of prepared solid lipid nanoparticles was regular with the diameter being （62.0±10.3） nm, the encapsulation efficiency was 98.29% and the loading rate was 8.17%. CONCLUSION： The selected preparation technique of OASLN is rational and practicable. It provides experimental evidence for developing a new oleanolic acid injection.
【Keywords】 oleanolic acid； solid lipid nanoparticles； quality evaluation
【摘要】 目的：对齐墩果酸固体脂质纳米粒的制备工艺和含量测定方法进行研究，并对其质量进行评价. 方法：采用薄膜超声分散法制备齐墩果酸固体脂质纳米粒，并对其包封率、形态等性质进行研究. 结果：制得齐墩果酸固体脂质纳米粒形态均匀圆整、粒径范围为(62.0±10.3) nm，包封率为98.29%，载药量为8.17%. 结论: 选择薄膜超声分散法制备齐墩果酸固体脂质纳米粒方法可行,为开发齐墩果酸新型注射制剂提供了实验依据.
【关键词】 齐墩果酸；固体脂质纳米粒；质量评价
0引言
齐墩果酸（oleanolic acid, OA）是一种五环三萜类化合物，国内临床上主要用于慢性肝炎的治疗以及多方面保肝作用［1］. 固体脂质纳米粒(solid lipid noparticles，SLN)系指以固态的天然或合成类脂如大豆磷脂、三酰甘油等为载体材料，将药物包裹或内嵌于类脂核中，制成粒径约为10～1000 nm的固体胶粒给药系统［2］. 本实验我们以大豆磷脂为载体，采用薄膜超声分散法制备齐墩果酸固体脂质纳米粒, 期望提高齐墩果酸的肝脏靶向性.
1材料和方法
1.1材料LC10AVP高效液相色谱仪（日本岛津公司），SephadexG50凝胶（Sigma公司），RE52旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），KQ250型超声波发生器（江苏昆山淀山湖检测仪器厂），BP190S电子天平（德国赛多利斯），齐墩果酸（陕西慧科公司,批号050322），大豆磷脂（上海太伟药业有限公司，批号040716）,其他试剂均为国产分析纯.
1.2方法
1.2.1齐墩果酸固体脂质纳米粒的制备精密称取处方量物质于100 mL圆底烧瓶中，加入15 mL氯仿溶解. 39℃旋转蒸发10 min除去氯仿，在烧瓶壁上形成一层薄膜. 加入60 mL/L甘露醇水溶液15 mL，40℃水浴超声30 min,0.45 μm微孔滤膜过滤，分装于安瓿中［3］.
1.2.2外观及其粒径取新制备的OA固体脂质纳米粒适量, 60 mL/L的甘露醇溶液超声分散,少许滴至专用铜网，用20 mL/L磷钨酸染色，自然干燥，使粒子在铜网上浓缩沉积，用电子显微镜观察并拍照.
1.2.3包封率及载药量的测定
1.2.3.1色谱条件色谱柱KromasilC18；流动相为甲醇∶水（90∶10）；流速1.0 mL/min；温度：室温；检测波长：210 nm；进样体积：20 μL. 在此色谱条件下，得OA固体脂质纳米粒色谱图，结果显示，共存组分不干扰主药测定（图1）.
1.2.3.2线性关系精密称取105℃干燥恒质量的OA对照品11.07 mg， 用甲醇溶解后， 移至10 mL容量瓶中， 甲醇定容至刻度， 摇匀， 精密量取此溶液（1.086 g/L） 3.0,2.0，1.0，0.5，0.3，0.1 mL分别置于6个25 mL的容量瓶中，然后在每个容量瓶中加入1 mL空白SLN，并用甲醇定容至刻度，摇匀，得浓度范围为4.34～130.32 mg/L的系列标准溶液. 分别取此系列标准溶液20 μL进样，计算峰面积的平均值.
图1OA固体脂质纳米粒高效液相色谱图 略
1.2.3.3回收率及精密度试验按照OASLN溶液中原辅料间的比例,精密称定,用甲醇稀释配制高、中、低三种不同浓度的供试品65.16，32.58，10.86 mg/L，取已知浓度的OA对照品溶液，用外标法依次测定含量，每次进样20 μL. 同时考察于室温25℃避光放置1 d和5 d的日内和日间变异性.
1.2.3.4载药量和包封率的测定采用凝胶柱层析法. 凝胶柱为SephedexG50,洗脱液为蒸馏水,流速为0.5 mL/min,层析温度为室温. 分别移取OA固体脂质纳米粒0.5 mL上柱，每3.0 mL收集一次，共收集25±3管. 以柱层析条件洗脱，应用HPLC测定SLN中药物含量以及游离药物量. 包封率=（W总-W游）/W总×100%. W总表示总药物含量，W游表示游离药物量. 载药量=（Wt-Wi）/WC×100%，其中Wt为SLN溶液中药物量，Wi为溶液中游离药物量，WC为大豆磷脂量［5］.
2结果
2.1纳米粒透射电镜观察OASLN为白色乳光胶体溶液，电镜下可见许多圆形或椭圆形球粒（图2）. 统计500个纳米粒,纳米粒的粒径（62.0±10.3） nm.
2.2线性关系考察以峰面积(A)为纵坐标，浓度(c， mg/L)为横坐标，进行线形回归分析，得标准曲线方程为：A=262673c-12207，r2=0.9994（图3）.
2.3回收率及精密度测试结果表明3种浓度样品中的日内RSD≤1.92％(n=6)， 日间RSD≤3.02％(n=6). 得平均回收率101.00%~103.00％之间(n=6)(表1).
2.4载药量和包封率按处方量进行了三次重复验证试验，制备3批固体脂质纳米粒，得平均包封率为98.29%，平均载药量为8.17%.
图2齐墩果酸固体脂质纳米粒透射电镜照片TEM ×10 000
图3系列标准溶液浓度对面积数据散点图 略
表1回收率及精密度测试结果（略）
3讨论
取OA对照品溶液,在紫外分光光度计上于波长200~400 nm处扫描,结果在207 nm处有最大吸收,为避免末端吸收,选择210 nm作为检测波长.
我们曾考察生理盐水、60 g/L甘露醇水溶液作分散介质的效果，采用生理盐水作分散介质的OA纳米粒放置后混浊、分层，而60 g/L甘露醇水溶液作分散介质在室温放置3 wk无混浊现象. 载药的纳米粒和游离的药物必须分离后才能测定包封率. 有报道采用离心法分离载药纳米粒和游离药物［8］，但高速离心时纳米粒有可能凝聚而被破坏，故本研究我们采用凝胶柱层析法分离, 实验结果显示分离效果良好.
OA具有强亲脂性，制成纳米粒是增加水中溶解度的良好方法. 采用薄膜超声分散法制备纳米粒简便易行，制备条件易控制，制备的纳米粒的成功率高，通过超声的办法使制备的纳米粒的粒径更均匀，适合于实验室制备和研究．大豆磷脂是细胞膜组成成分，毒性低于合成材料，体内可以降解且有良好生理相容性，价廉易得，故选其作为药物载体.
【参考文献】
［1］ 王德仁. 齐墩果酸研究新进展［J］. 天津药学， 2003， 15（3）: 56-58.
［2］ Trotta M， Pattarino F， Ignoni T. Stability of drugcarrier emulsions containing phosphatidyl choline mixtures［J］. Eur J Pharm Biopharm，2002，53（4）：203-208.
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［5］ 邓世星，孙志勇，周卿，等. 紫外光谱法测定齐墩果酸含量［J］. 遵义医学院学报，2003，26(6)：556.
［6］ 李琴韵，张雷. 中国HPLC测定左归颗粒中熊果酸和齐墩果酸的含量［J］. 中药杂志， 2005，30（4）：308-309.
［7］ 向大雄，陶昱斐，王峰，等. 齐墩果酸固体分散体形成和增溶机制研究［J］.中草药，2002，33(4)：311.
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