Ets―1表达与宫颈鳞癌组织微血管微淋巴管生成、癌细胞增殖、浸润转移及预后的关系
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[摘要]目的：探讨宫颈鳞癌组织ets-1表达及临床意义。方法：采用免疫组织化学法检测28例正常宫颈上皮（normal cervical epithelium，NCE）、36例宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasm，CIN）和68例宫颈鳞癌（squamous carcinoma of cervix，SCC）组织Ets-1的表达情况，并检测CD34标记的微血管密度（microvessel density，MVD）、VEGFR-3标记的微淋巴管密度（lymphatic microvessel density，LMVD）和MIB-1标记的增殖指数（proliferation index，PI）。结果：Est-1在NCE、CIN及SCC组的阳性表达率分别为3.57%、30.56%和69.12%。从NCE到CIN，再到SCC组，Est-1阳性表达率显著升高（P>0.01）。Est-1分别在CIN及SCC组阳性表达者MVD均分别显著高于阴性表达者（P<0.05）。Est-1在CIN和SCC组表达均分别与MVD显著正相关（CIN组：r=0.390，P=0.019;SCC组：r=0.567，P=0.000），但与LMVD及PI无关（P>0.05）。Est-1在SCC组表达分别与盆腔淋巴结转移及间质浸润深度密切相关（P<0.05），而与患者年龄、FIGO分期、组织学分级、脉管浸润及生存率无关（P>0.05）。宫颈鳞癌有盆腔淋巴结转移及突破深肌层间质浸润者，其Est-1阳性表达率分别显著高于无盆腔淋巴结转移及浸润深度在浅肌层间质以内者（P<0.05）。结论：Ets-1可能参与在宫颈鳞癌的发生发展过程。Ets-1在CIN及SCC组表达上调可能促进血管新生及肿瘤转移。
[关键词]宫颈肿瘤;Ets-1;血管生成;淋巴管生成;肿瘤转移;免疫组织化学
[中图分类号]R737.33 [文献标识码]A
Ets-1作为转录因子参与细胞的增殖分化、血管生成、细胞凋亡等过程，同时在肿瘤浸润转移中也发挥重要作用，主要与某些降解细胞外基质酶的转录激活有关，这些酶包括基质金属蛋白酶（MMPs）等[1]。Ets-1在乳癌、胃癌、胰腺癌、甲状腺癌、卵巢癌等多种肿瘤中高表达，并与肿瘤浸润转移、血管生成、不良预后等密切相关。Ets-1表达与宫颈鳞癌关系的研究少见报道。本研究采用免疫组化法检测Ets-1在宫颈鳞癌组织的表达情况，探讨其表达与局部微血管微淋巴管生成、癌细胞增殖、浸润转移及预后的关系。
1材料与方法
1.1 材料 选自1998年03月26日～2005年06月21日在福建医科大学附属第一医院手术治疗的36例宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasm，CIN）和68例宫颈鳞状细胞癌（squamous carcinoma of cervix，SCC）病人作为研究对象。所有研究对象术前均未经过化疗、放疗及免疫治疗，并均经病理确诊。选取28例因功血或子宫肌瘤行子宫切除术的正常宫颈上皮（normal cervical epithelium，NCE）作为对照。CIN分级及宫颈癌组织学分级和FIGO分期参照文献[2]。68例宫颈鳞癌患者年龄24～72岁，中位年龄45岁，<45岁者30例，≥45岁者38例。CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ级分别为12、11和13例。鳞癌FIGO分期Ⅰ期32例，Ⅱ期36例;组织学分级Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级分别2、19和47例;脉管浸润34例，盆腔淋巴结转移17例;镜下早期浸润癌5例，明显间质浸润癌63例（浅、深肌层浸润各15和48例）。从手术当日到2006年12月31日止，对本组68例宫颈鳞癌患者进行随访，共随访到53例，随访率77.94%，随访时间5～93个月，平均54.8个月。在随访到的53例中死亡14例，3年生存率74.51%（38/51），5年生存率67.44%（29/43）。
1.2试剂 鼠抗人Est-1单克隆抗体（克隆号，工作浓度1∶100）、鼠抗人CD34单克隆抗体（克隆号QBEND/10）、鼠抗人MIB1单克隆抗体（克隆号MIB1）、即用型UltraSensitiveTM SP超敏试剂盒（Cat.No：KIT-9710）及DAB染色剂等购自福州迈新生物技术有限公司。浓缩型兔抗人VEGFR-3多克隆抗体（产品编号ZA-0267，工作浓度1∶100）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.3方法 所有新鲜标本均经4%甲醛溶液固定，48h内取材，石蜡包埋，连续3～5μm厚度切片。采用免疫组化SP法检测CIN和宫颈鳞癌组织中Est-1、CD34、VEGFR3和MIB1的表达情况。具体步骤按说明书进行。Est-1、CD34、VEGFR3和MIB1均采用柠檬酸缓冲液高压热力修复抗原，DAB显色。Est-1、CD34、VEGFR3和MIB1进行苏木素复染。用已知阳性片作为阳性对照，用PBS代替第一抗体作为阴性对照。
1.4结果判断 Est-1判断标准参照文献[3]：Ets-1主要定位于细胞质和（或）细胞核，以细胞质和（或）细胞核内出现黄褐色颗粒为阳性。在光镜下随机观察具有代表性的10个高倍视野（×400），每个视野记数100个肿瘤细胞，按阳性细胞数占视野中总细胞数的百分比分为3级：<10%为阴性（-）;10%-50%之间为阳性（+）;>50%为强阳性（++）。CD34标记的微血管密度（microvessel density，MVD）：CD34表达于血管内皮细胞质，呈棕黄色染色，其判断标准及脉管浸润的判断标准参照文献[4]。VEGFR3标记的微淋巴管密度（lymphatic microvessel density，LMVD）：VEGFR-3阳性染色主要位于肿瘤边缘及间质微淋巴管内皮细胞质，呈棕黄色染色，可见微淋巴管内皮细胞围成壁薄、形态不规则的管腔结构，内无红细胞。LMVD判断标准参照文献[5]。MIB1标记的增殖指数（proliferation index，PI）：MIB1在细胞核表达，阳性染色者细胞核呈棕黄色。在光镜下随机观察具有代表性的10个高倍视野（×400），每个视野记数100个肿瘤细胞，计算其阳性标记细胞数即为PI。
1.5统计学分析 采用SPSS11.5统计软件包进行分析，计数资料采用非参数c2检验，定量资料比较采用方差分析，变量间的关系采用相关分析，生存情况采用Kaplan-Meier曲线表示，Log rank检验。检验水准α=0.05，以P<0.05有统计学意义。
2结果
2.1Est-1在NCE、CIN及SCC组的表达
Est-1在NCE、CIN及SCC组的阳性表达率分别为3.57%、30.56%和69.12%，从NCE到CIN及SCC，Est-1阳性表达率显著升高（c2=38.371，P=0.000）。Est-1在NCE组仅1例阳性表达，主要表达于上皮细胞质，在CIN组主要表达于异型细胞质和（或）核，在SCC组主要弥漫性表达于癌细胞质和（或）细胞核。Est-1在SCC组的表达见图1。
图1 Ets-1在宫颈癌中阳性表达（SP×200）
表1 Est-1在NCE、CIN及SCC组的表达
Tab.1 Expression of Est-1 in NCE， CIN and SCC group
Group
n
Est-1
Positive rate
Mean Rank
c2
P
（-）
（+）
（++）
NCE
28
27（96.43）
1（3.57）
0（0）
3.57
39.13
CIN
36
25（69.44）
10（27.78）
1（2.78）
30.56
56.00
SCC
68
21（30.88）
35（51.47）
12（17.65）
69.12
83.33
38.371
0.000
非参数检验Kruskal-Wallis Test
2.2Est-1在CIN及SCC组的表达分别与MVD、LMVD及PI的关系
在NCE、CIN及SCC组，CD34标记的MVD分别为6.3±2.9、18.0±4.7及58.2±19.6条;VEGFR-3标记的LMVD分别为2.24±3.8、6.37±5.7和8.3±2.8条;MIB1标记的PI分别为96.0±54.6、300.0±157.1及378.7 ±199.6。从NCE到CIN再到SCC组，MVD、LMVD及PI均显著升高（MVD组：CIN vs NCE，P=0.000，SCC vs CIN，P=0.000，SCC vs NCE，P=0.000;LMVD组：CIN vs NCE，P=0.003，SCC vs CIN，P=0.176，SCC vs NCE，P=0.000;PI组：CIN vs NCE，P=0.000，SCC vs CIN，P=0.043，SCC vs NCE，P=0.000）。在CIN及SCC组，Est-1阳性表达者MVD均分别显著高于阴性表达者（P<0.05），但Est-1阳性表达者LMVD和PI均分别与阴性表达者比较无显著性差异（P>0.05）。Pearson相关分析显示，Est-1在CIN和SCC组表达均分别与MVD显著正相关（CIN组：r=0.390，P=0.019;SCC组：r=0.567，P=0.000），但Est-1在CIN和SCC组表达均分别与LMVD（CIN组：r=0.099，P=0.565;SCC组：r=0.016，P=0.896）及PI（CIN组：r=0.037，P=0.831：SCC组：r=0.086，P=0.484）无关。CD34、VEGFR3和MIB1在SCC组表达分别见图2A、2B和2D。
A
B
C
A：CD34在宫颈鳞癌间质血管呈阳性表达（SP×200），癌巢间质血管内皮细胞质被染色呈黄棕色
B：VEGFR-3在宫颈鳞癌边缘淋巴管呈阳性表达（SP×200），淋巴管上皮细胞质被染色呈黄棕色。
C：MIB1在宫颈鳞癌呈阳性表达（SP×100），癌细胞核被染色呈黄棕色。
图1 CD34、VEGFR3和MIB-1在宫颈鳞癌的表达
表2 Est-1在CIN和SCC组表达分别与MVD、LMVD及PI的关系
Tab.2 The relationship between expression of Est-1 with MVD， LMVD and PI in CIN and SCC group
组别
例数
MVD
LMVD
PI
CIN组
Est-1 （-）
Est-1（≥+）
SCC组
Est-1 （-）
Est-1（≥+）
25
11
21
47
16.8± 4.7
20.3± 4.0a
43.4±14.9
64.8±17.8b
6.3±5.5
6.6±6.4c
8.4±2.7
8.3±2.9d
293.0±164.1
310.0±146.3e
396.8±209.6
370.7±196.7f
注：组内方差分析：aF=4.499，P=0.041;bF=22.869，P=0.000;cF=0.015，P=0.904;dF=0.023，P=0.881;eF =0.160，P =0.692;fF=0.246，P =0.622。
2.3Est-1在SCC组的表达与临床病理特征的关系
Est-1在SCC中表达与盆腔淋巴结转移及间质浸润深度密切相关（P<0.05），而与患者年龄、FIGO分期、组织学分级及脉管浸润无关（P>0.05）。宫颈鳞癌有盆腔淋巴结转移及突破深肌层间质浸润者，其Est-1阳性表达率分别显著高于无盆腔淋巴结转移及浸润深度在浅肌层间质以内者（P<0.05）。
表3 Est-1在SCC组的表达与临床病理特征的关系（x±s）
Tab.3 The relationship between Est-1 expression and clinicopathologic characteristic in SCC group （x±s）
临床病理特征
n
Ets-1
c2
P
（-）
（≥+）
年龄/岁
<45
30
9（30.0）
21（70.0）
≥45
38
12（31.6）
26（68.4）
0.020
0.889
FIGO分期
Ⅰ
32
12（37.5）
20（62.5）
Ⅱ
36
9（25.0）
27（75.0）
1.240
0.265
组织学分级
≤Ⅱ
21
9（42.9）
12（57.1）
Ⅲ
47
12（25.5）
35（74.5）
2.041
0.153
盆腔淋巴结转移
无
51
19（37.3）
32（62.7）
有
17
2（11.8）
15（88.2）
3.881
0.049
突破深肌层间质浸润
无
20
10（50.0）
10（50.0）
有
48
11（22.9）
35（77.1）
4.851
0.028
脉管浸润
无
34
9（26.5）
25（73.5）
有
34
12（35.3）
22（64.7）
0.620
0.431 Est-1在SCC组的表达与预后的关系
将Est-1在SCC组的表达分为阳性和阴性两组，两组Kaplan-Meier生存曲线见图3。Est-1阳性表达组患者的生存率与阴性低表达组比较无统计学差异（log rank检验，P=0.6527）。
图3 Est-1高表达组和低表达组宫颈鳞癌患者Kaplan-Meier生存曲线
Fig.3 Kaplan-Meier survival curve in patients with the higher and lower Est-1 expression in SCC group
3讨论
3.1 Est-1表达与子宫颈鳞状细胞癌局部微血管微淋巴管和增殖指数的关系
在成熟的正常器官组织中几乎未发现有明显的新生毛细血管、微淋巴管形成，增殖中的细胞也呈一定的比例。肿瘤作为过度增生的组织其新生毛细血管、微淋巴管形成交前者明显增加，细胞增殖也明显较前活跃。孙晋瑞、齐碧如等的研究证实了宫颈癌这一点.. 组织中MVD和LMVD水平均高于正常组织，差异均有统计学意义[6.7] 。本研究中，在NCE、CIN及SCC组，MVD、LMVD、MIB1均显著升高.与之一致。但Est-1表达与子宫颈鳞状细胞癌局部微血管微淋巴管生成和增殖指数的关系系统的研究未见相关报导。
Ets - 1参与新生血管形成的过程。一系列与血管生成相关分子的基因启动子区都含有Ets 结合位点。血管内皮细胞生长因子（ VEGF） 通过与其特异性受体Flt- 1、KDR/FLK - 1 和neuropilin - 1 结合而发挥作用，Flt - 1的启动区含有大量的Ets 结合位点，且Flt - 1 的表达依赖于Ets - 1 和Ets - 2。基质降解及血管内皮细胞的迁移是血管新生起始阶段的的特征。基质降解与血管内皮细胞产生的大量蛋白水解酶如MMPs、uPA 等有关，而内皮细胞迁移与整合素（ integrins）有关[8]。在MMPs[9]、uPA、integrins 基因的顺式作用元件区均有与转录因子Ets - 1 结合的基序，Ets - 1 促进这些基因的表达。Sato 等[10]构建了Ets - 1 高表达组和低表达组的内皮细胞系，发现Ets - 1 高表达组中MMPs 和integrinβ3的表达明显上调，说明Ets - 1 通过诱导内皮细胞中MMPs 和integrinβ3 的表达，使内皮细胞具有血管生成功能的表型。VEGF 和bFGF 诱导内皮细胞中转录因子Ets - 1 的表达，Ets - 1 又通过与靶基因uPA、MMPs 和整合素β 上Ets 基序结合是内皮细胞转化成具有血管生成功能的表型，这可能是Ets - 1 促进肿瘤血管新生的重要机制。可见Ets - 1在血管形成过程中起着不可忽视的作用， 本研究显示：从NCE到CIN，再到SCC组，Est-1阳性表达率显著升高（P>0.01）。Est-1分别在CIN及SCC组阳性表达者MVD均分别显著高于阴性表达者（P<0.05）。Est-1在CIN和SCC组表达均分别与MVD显著正相关。
ntergrina 在微淋巴管的形成过程中发挥着重要的作用。Ang2淋巴管的重塑和成熟起着至关重要的作用。缺乏Ang2即缺乏成熟淋巴管 [11] ，Ets - 1 促进这些基因的表达[12]。同时E ts- 1通过P21WAF1 /CIP1 旁路发挥抑制凋亡和促进增殖作用。
Ets-1在宫颈癌中与微淋巴管的关系国内未见少见报到，本研究显示Est-1在CIN和SCC组表达均分别与LMVD及PI无关.故笔者认为在宫颈鳞癌发展过程中，Ets-1可能不直接参与淋巴管生成和肿瘤增殖，但间接促进淋巴管的生成和宫颈癌细胞增殖。
3.2 Ets-1表达与子宫颈鳞状细胞癌浸润转移及预后
在恶性肿瘤时， Ets-1在其发展/转移的过程中也起着举足轻重的作用。研究发现，许多恶性肿瘤如胃癌、肝细胞肝癌中均有Ets-1的高表达[13]。某些白血病和淋巴瘤患者Ets-1基因发生转位，部分结肠癌患者染色体的11q23 发生杂合性丢失，均提示Ets-1基因可能在突变后被激活，出现基因结构的改变或表达异常，产生特异性转化蛋白质，使细胞代谢异常最终致恶性转化。本研究发现，Est-1在NCE组仅1例阳性表达，主要表达于上皮细胞质，在CIN组主要表达于异型细胞质和（或）核，在SCC组主要弥漫性表达于癌细胞质和（或）细胞核。故笔者认为宫颈癌组织存在Ets-1高表达，宫颈癌患者可能存在Ets-1基因的突变。另MVD增高增加了肿瘤的血供，大量的肿瘤血管、淋巴管的形成又增加了肿瘤细胞进入血液循环、发生远处转移的机会;同时新形成的微血管、微淋巴管在形态和结构上也存在明显的缺陷，大量的连接处开放形成较宽的间隙，且有部分内皮细胞的完整性被破坏，癌细胞即可经这些间隙进入血管淋巴管，从而实现转移。其基底膜较为薄弱且存在较大的裂隙，使肿瘤细胞能容易地侵入有缺陷的微血管和微淋巴管而产生转移。本研究示Est-1在CIN和SCC组表达均分别与MVD显著正相关，与微淋巴管虽不相关但在其形成增加过程中可能也发挥了一定作用。基底膜（ BM） 是阻止肿瘤细胞侵袭和转移的天然屏障。宫颈癌中BM 大部分缺失而且分期越晚BM 受损越严重[ 14]。在肾小球硬化及间质纤维化进程中，Ets-1诱导基质金属蛋白酶3 蛋白的表达上调参与肾组织损伤及基质重塑过程[15]，既往研究也显示Ets-1能诱导活化基质金属蛋白酶、尿激酶型血浆酶原激活因子等降解细胞外基质进而发生浸润转移[16]。故笔者认为Ets-1过度表达除了通过促进血管生成来增加宫颈癌的侵袭能力，还可直接促使宫颈癌细胞突破淋巴管及血管的BM 向深层间质浸润。Est-1在SCC中表达与盆腔淋巴结转移及间质浸润深度密切相关（P<0.05），宫颈鳞癌有盆腔淋巴结转移及突破深肌层间质浸润者，其Est-1阳性表达率分别显著高于无盆腔淋巴结转移及浸润深度在浅肌层间质以内者（P<0.05）。而，与患者年龄、FIGO分期、组织学分级及脉管浸润无关（P>0.05）。Est-1阳性表达组患者的，生存率与阴性低表达组比较无统计学差异，是否还存在其他的原因或需扩大样本有待进一步研究。.
可见：Ets-1可能参与在宫颈鳞癌的发生发展过程。Ets-1在CIN及SCC组表达上调可能促进血管的新生及肿瘤转移。近年来， E ts-1显性负性突变体[17]及其反义寡核苷酸链分子[18] 的研究已取得阶段性成果. 抗E ts-1的分子靶向治疗将有望成为宫颈癌治疗的新策略。
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