胱氨酸血症与复发性流产

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复发性流产(recurrentpregnancyloss,RPL)是指连续≥2次发生在妊娠20周以内的自然流产,发生率为1%~5%[1]。RPL病因复杂,其中50%以上病例病因不明。有研究表明[2,3],遗传性血栓倾向与RPL有关,另有研究表明[4-8],5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(methylenetetra-hydrofolatereductase,MTHFR)多态性(C677T)与RPL相关,但国外研究报道则存在争议。目前MTHFR基因、血同型半胱氨酸水平(homocysteine,Hcy)和RPL的关系结论尚不一致。故本研究的目的是明确MTHFR基因多态

性(C677T)与高Hcy血症以及RPL之间的关系,并通过随访其再次妊娠结局,以进一步寻找RPL的病因,进而为诊断及治疗提供依据。1资料与方法

1.1研究对象选择2006.06~2009.01期间于我院就诊的复发性自然流产患者为病例组,纳入标准:夫妇双方染色体正常,抗心磷脂抗体、抗核抗体阴性,无甲状腺机能亢进、糖尿病、高血压等内科合并症,年龄≤40岁;入组患者需同时符合以上条件。另征集同期健康体检的本院及进修医生为对照组,纳入对象需同时符合以下条件:已正常生育且月经规律、无自然流产史、无妊娠高血压、无甲状腺机能亢进、高血压、糖尿病等内科合并症者、年龄≤40岁。本研究经本院伦理委员会批准,所有对象均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1标本采集及同型半胱氨酸(Hcy)测定收集所有对象的一般临床资料,同时采集4ml肝素抗凝血,-20℃冰箱保存,待用于提取DNA;另4ml非抗凝血,于取血后2h内1000×g离心15min,提取血清冻存于-20℃冰箱内,待测同型半胱氨酸(Hcy)。血清Hcy测定采用北京九强生物技术有限公司生产的检测试剂盒(酶法)测定,操作按试剂盒说明书要求进行。

1.2.2基因组DNA提取按DNA提取试剂盒(北京天根生化有限公司)说明书要求操作,从全血标本中提取基因组DNA。

1.2.3聚合酶链式反应(PCR扩增)按照文献[3]所示引物序列合成MTHFR引物,上游引物为:5'-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3',下游引物为:5'-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3',预计扩增片段长度为198bp。PCR总体积25μl,扩增条件为:94℃预变性5min;94℃变性1min,57℃退火1min,72℃延伸1min,共35个循环最后72℃末端延伸5min;PCR产物经20g/L琼脂糖凝胶电泳检测验证。

1.2.4限制性内切酶消化(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)限制性内切酶反应采用20μl反应体系,试剂盒购自美国NEB公司,操作按试剂说明书要求进行,其中2号反应缓冲液2μl,PCR产物8μl,BSA0.2μl,内切酶Hinf1μl,双蒸水8.8μl,37℃水浴过夜。25g/L琼脂糖100V电泳25min,溴化乙锭(EB,Sigma公司)染色后在紫外灯下读取基因型。

1.3结果判断MTHFR677基因扩增片段应为198bp,如在677位点基因型为TT,则此位点能被内切酶Hinf切开产生175bp、23bp2个片段,电泳后23bp片段太小不能显示在电泳图上,电泳图上仅表现为175bp的1条条带;如在677位点为CC,则不能被内切酶切开,就只有1条198bp的条带;如在677位点为CT,酶切后共产生3个片段:198bp、175bp、23bp,电泳图上表现为198bp、175bp2个条带。1.4随访所有病例组对象每半年电话随访1次,询问并记录再次妊娠结局及妊娠相关情况:是否早产、妊娠并发症情况及分娩方式、新生儿情况等。

1.5统计学方法所有数据输入SPSS11.1统计软件进行分析,采用t检验、χ2检验、方差分析进行组间比较。数据以均数±标准差(x-±s)或率(%)表示,以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1一般情况病例组共纳入71例,其中2例为孕16~20周流产,其余69例均为早期流产(孕3个月内);连续2次流产者44例,连续3次及以上流产者27例(其中3次19例,4次4例,5次4例)。正常对照组共征集到58例,对照组年龄(34.2±3.9岁)高于病例组(31.2±4.4岁),差异有统计学意义(P<0.05);组间体质量指数无统计学差异(P>0.05)。

2.2MTHFR基因C677T分布情况MTHFR基因677位点的3种基因型分布组间比较,差异有统计学意义(χ2=15.3,P=0.000)。其中CC基因型在病例组显著降低(P=0.000,OR=0.244,95%CI:0.115~0.521);TT基因型的分布组间无统计学差异(P=0.60),详见表1。T等位基因的频率在病例组显著升高(60.4%vs44.0%,P=0.005),详见表2、图1。2.3高Hcy与MTHFR基因分布、RPL的关系病例组与对照组比较,血Hcy水平组间无差异:病例组为15.0±7.6nmol/L,对照组为14.1±7.5nmol/L(P>0.05)。病例组高同型半胱氨酸血症者(Hcy≥15nmol/L)占38.0%(27/71),对照组为32.8%(19/58),亦无统计学差异(OR=1.26,95%CI:0.608~2.609,P>0.05)。在所有对象中,MTHFR基因677位3种基因型的Hcy水平检测结果显示,TT基因型Hcy水平显著升高:CC基因型为13.1±6.2nmol/L,CT基因型为11.7±4.0nmol/L,TT基因型为19.0±9.5nmol/L,3种基因型分布有显著差异(P=0.000)。

2.4妊娠结局病例组中27例高同型半胱氨酸者均给予叶酸(北京北大药业)5mg,qd,治疗1个月后复查血Hcy,均降至正常,随后改为叶酸0.4mg,bid。其中有9例再次怀孕:7例(均为TT基因型)妊娠单胎至足月(其中1例应用阿司匹林,1例应用肝素均在孕3个月后停用),母、婴均健康;1例(CT基因型)27岁,有2次胚胎停育史,本次叶酸治疗后血Hcy降至正常,促排卵后双胎妊娠,至孕5月因胎膜早破流产;1例(CT基因型)39岁,有3次胚胎停育史,其母亲有糖尿病史,叶酸治疗后血Hcy降至正常,自然单胎妊娠至孕32周,因妊娠高血压、妊娠糖尿病、胎儿宫内生长受限行剖宫产,早产女婴1300g,现出生8个月,体健。

3讨论

3.1MTHFR基因与复发性流产(RPL)亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是调节半胱氨酸和四氢叶酸代谢的关键酶。MTHFR基因位于染色体的1p36.3,MTHFR基因677位核苷酸CT突变后,此位点的氨基酸由丙氨酸转化为缬氨酸,导致MTHFR酶活性降低,5-甲基四氢叶酸生成减少,同型半胱氨酸(Hcy)复甲基化通路受阻,体内Hcy积聚,引起血液中高同型半胱氨酸血症。2005年任爱国等综述国内仅有的4项研究[4],但结果不尽相同,我们的结论与汪希鹏等结论[5]一致,MTHFR基因C677T的CC基因型在病例组显著降低,而TT基因型组间无差异;等位基因T在病例组明显高于对照组。但本研究中TT基因型病例组占36.5%,对照组占31.0%,与管立学等的报道[6]相似。而来自山东的徐俐等报道[7],TT基因型在复发性流产组与对照组分别是38.4%和18.0%,差异显著(P<0.05)。Callejon等研究观察到[8],在自然流产胎儿组织中MTHFR基因多态更常见,而且CC基因型对自然流产有显著的保护作用,与本研究结论相一致。虽然国外研究还存在争议,但普遍已把此项检查列为RPL诊断的常规检查项目。

3.2高Hcy血症与RPL同型半胱氨酸是由蛋氨酸脱甲基生成的一种含硫氨基酸;四氢叶酸在5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)作用下生成5-甲基四氢叶酸,5-甲基四氢叶酸与Hcy在蛋氨酸合酶作用下生成蛋氨酸和四氢叶酸。维生素B12和叶酸是蛋氨酸合酶的辅助因子,因而补充叶酸和维生素B12可以降低血浆Hcy水平。高同型半胱氨酸血症是动脉硬化、静脉血栓、神经管缺陷、胎盘早剥、胎盘梗死、先兆子痫以及复发性早期自然流产的高危因素[3]。Nelen等报道[9],MTHFR基因677TT基因型与高同型半胱氨酸有关,导致复发性自然早期流产2~3倍的高风险。Nelen等进行的Meta分析结果表明[10],MTHFR基因TT基因型和高Hcy血症均是RPL的危险因素,但Hcy更加敏感。尽管高Hcy与RPL有临床流行病的证据,但其病理、生理原因仍不明确。Nelen等研究显示[11],高Hcy引起绒毛膜的血管化缺陷与RPL有关。Jaslow等建议[12],应对RPL患者同时筛查空腹Hcy和MTHFR基因多态。我们的研究显示MTHFR基因TT基因型与高同型半胱氨酸血症有关,但在病例(复发性流产)组和对照组间却未显示差异。分析原因可能是因为未排除流产组患者近期服用叶酸而使本来可能增高的Hcy水平处于正常有关。

3.3高Hcy血症与叶酸治疗研究证实[13],叶酸治疗高同型半胱氨酸血症有效。但高同型半胱氨酸血症的治疗目前尚无统一标准,普遍认为补充叶酸、维生素(Vit)B12、VitB6等有效。Ford等推荐[14]:补充叶酸0.4~1.0mg/d,VitB66mg/d和VitB120.025mg/d。在我们的研究中,27例高Hcy血症者叶酸治疗有效,叶酸5mg/d,1个月后复查血Hcy全部降至正常,正常后改为0.4mgbid。9例再次妊娠中7例达足月妊娠,其中1例应用阿司匹林,1例应用肝素均在孕3个月后停用。提示口服叶酸治疗高Hcy血症后,有助于RPL妇女再次妊娠成功至足月。

总之,我们的研究提示MTHFR基因多态性(C677T)与RPL有关;MTHFR基因TT基因型能引起高Hcy血症;高Hcy血症可以经口服大剂量叶酸治疗得以纠正。因而我们提出对RPL患者筛查Hcy水平,并予以适当治疗,这有助于改善该类患者的下次妊娠结局。