木素模型物漆酶合特征

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1前言

木素是最复杂的天然高聚物之一，与纤维素和蛋白质不同，其结构单元间缺少规律性和有序性，而且木素在细胞壁中与聚糖之间发生化学结合(如LCC)及物理缔合，因此目前还没有将木素完整地从植物组织中抽出的技术，这些都给木素的研究带来很大的困难[1]。为了更好地研究木素在制浆、漂白等过程中的反应机理、木素在植物体内合成机制及木素的综合利用，人们引入了木素模型物的概念，以便从分子水平对木素进行研究[2]。联苯结构(5-5’)是木素重要的分子结构单元，这种缩合型木素结构中2个5位碳原子连接的C-C键以及苯环本身在制浆漂白过程中都非常难以降解，并且容易进一步与碳水化合物形成新的木素-碳水化合物复合体(LCC)结构[3]。在废水处理中这类缩合型木素结构可生化性差，传统的方法很难除去[4]。因此联苯型木素结构的合成，对于研究制浆造纸过程中木素结构的变化具有重要的意义。漆酶是一种多功能的多酚氧化酶[5]，可催化氧化酚类及芳胺类等多种底物[6]，在这一过程中，漆酶从底物中提取一个电子[7]，使之形成自由基[8]，自由基非常活泼，会进一步发生聚合或降解反应。因此，漆酶在生物漂白、废水处理、生物传感器构建[9]及有机合成等方面具有很好的应用前景。香草醛羟基氧原子上的孤对电子与苯环形成p-π共轭，具有供电子效应，使苯环电子云密度增加，并且邻对位电子云密度增加较多。香草醛与漆酶反应时，其酚羟基的电子被夺走而形成酚氧自由基，酚氧自由基存在共振结构，即5-位具有自由基性质，可以发生5-5偶合，形成二聚体化合物。由于联苯结构空间位阻效应较大，对自由基具有共轭稳定效应，使自由基的活性降低，阻碍此二聚体聚合成高聚物，因此香草醛只能脱氢缩合形成脱氢香草醛二聚体。根据漆酶的特性及已有的研究结果，本实验设计了以香草醛为底物在漆酶催化下合成脱氢香草醛，得率达78.3%；再用硼氢化钠将其还原为脱氢香草醇，即得联苯型木素模型化合物。通过正交试验设计探讨了影响脱氢香草醛得率的主要因素，对工艺进行了优化，取得了理想的结果。

2实验部分

2.1实验仪器与材料北京泰克显微熔点仪；IKA-RV10旋转蒸发仪；日本岛津UV-2550紫外-可见分光光度计；傅里叶变换红外光谱仪，KBr压片；VarianInova600MHz核磁共振仪，溶剂DMSO-d6，内标TMS。漆酶液(NovozymesChina)；香草醛、硼氢化钠均为分析纯；三氯甲烷、无水硫酸钠、氢氧化钠均为化学纯；双蒸水；高纯氮。

2.2实验方法

2.2.1漆酶酶活的测定取2mL0.5mmol?L?1的ABTS溶液(用pH4.5的HAc-NaAc缓冲液配制)，加入1mL适当稀释的酶液启动反应，在室温下测定反应体系在420nm处的吸光度在前3min的变化。每分钟氧化1μmolABTS所需要的酶量定义为一个酶活单位。实验测得，所用漆酶液的酶活为1612IU?mL?1。

2.2.2脱氢香草醛的合成在装有回流冷凝管的三颈瓶中加入1.00g香草醛和20mL乙醇，磁力搅拌使其完全溶解，然后加入20mL不同pH值的磷酸盐-柠檬酸缓冲液；再加入一定量的漆酶，在曝气条件下反应5h，反应过程中观察到溶液由无色变为浅黄色，最后有褐色的固体析出。反应结束后，将混合物用砂芯漏斗过滤，再分别用蒸馏水、乙醇、丙酮多次洗涤该固体残留物，以除去残留的漆酶和香兰素。将此固体残留物真空干燥，得到脱氢香草醛0.783g，得率78.3%，熔点305~310℃(文献值306~312℃)。

2.2.3联苯型木素模型物的合成在搅拌条件下，将1.0g脱氢香草醛溶于盛有150mL0.1mol?L?1的NaOH溶液的三口烧瓶中，通入氮气，快速加入0.4g硼氢化钠，恒温水浴30℃下反应12h；反应结束后用稀盐酸调pH至3，然后用三氯甲烷抽提，再用双蒸水洗涤氯仿层若干次，并用无水硫酸钠干燥5h；减压蒸发掉三氯甲烷后得到褐色固体，即为联苯型木素模型物(脱氢香草醇)。熔点187~191℃，产物0.695g。总合成路线如图1所示.

3结果与讨论

3.1利用漆酶催化脱氢反应的优点联苯型木素模型化合物传统的合成方法是以香草醛为底物，在辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，简称HRP)与双氧水组成的催化氧化体系下合成脱氢香草醛，再经NaBH4还原而制备。这个反应的时间较长，一般需要12h以上；由于该反应需要双氧水，所以必须严格控制双氧水的浓度才能保证HRP既能保持较高的活性又不至于失活，因此该反应较难控制，且得率很低。此外，HRP价格昂贵，限制了模型物的大量合成。由于漆酶可以直接以O2为电子传递体实现氧化还原作用[10]，所以反应过程中仅需曝气即可，反应时间只需5h，成本较低，得率较高。3.2产物结构的表征

3.2.1脱氢香草醛的结构表征图2为脱氢香草醛的红外光谱图。从图中可以看出，产物在3261.1cm?1处有较强的-OH特征吸收峰，说明该物质中可能含有醇羟基或酚羟基；在1258.6cm?1处也有吸收峰，这是酚羟基的面内弯曲振动，所以判定该物质含有酚羟基；2965.5cm?1处可鉴定为C-H伸缩振动吸收峰；图中1585.9cm?1、1504.6cm?1处为苯环的特征吸收峰；产物在1673.3cm?1处的较强吸收，表明了共轭羰基的存在。此外，由该化合物的1H-NMR谱图(图3)可以看出：在δ3.793~3.881处(c峰)为甲氧基的吸收峰；在δ7.383~7.387处(b峰)为苯环上的C-H特征位移；在δ9.763~9.768处(a峰)为苯环上α位羰基相连的质子。图3表明，该化合物含有3种质子，经过积分，它们的面积比a:b:c为1:1.99:2.98，近似为2:4:6，这与脱氢香草醛中三种质子的个数比相同。综合红外谱图及氢核磁谱图分析，可以确定该产物为脱氢香草醛。

3.2.2脱氢香草醇的结构表征图4为脱氢香草醛的红外光谱图，从图中可以看出，在3504.2cm?1处有一个强的吸收峰，此为二聚体羟基吸收峰，表明该物质为含有羟基的二聚体；此外在3311cm?1附近的谱带是多个羟基的特征吸收峰；在2933.5cm?1处为-C-H-的伸缩振动吸收峰；在波数为1594.6cm?1、1506.1cm?1等处有较明显的苯环的特征吸收峰，说明了该物质是含有苯环的二聚体结构。与脱氢香草醛的红外图谱(图2)比较可以看出，在1673.3cm?1处的共轭羰基的特征吸收峰消失，说明脱氢香草醛的共轭羰基已被完全的还原为羟基。由1H-NMR谱图(图5)可以看出：在δ3.746~3.814(f峰)处有两个吸收峰，该位移为甲氧基的吸收，经过积分，得出共有6个H原子，即该二聚体含有两个甲氧基；在δ6.670~6.885(d峰)处为苯环上的-CH特征位移，经过积分，得到芳香族的质子为4个；在δ4.365~4.405(e峰)处的信号是α位质子，积分值为4，说明含有2个亚甲基。综合以上两种分析结果可以确定最终的产物为联苯型木素模型物。3.3漆酶反应条件的选择影响脱氢香草醛得率的主要因素有：漆酶用量(以每克香草醛计，下同)、温度和pH值，为了寻找最优的反应条件，设计了三因素三水平正交试验。其因素水平编码见表1，正交设计试验及结果见表2。

3.3.1漆酶用量对产率的影响从表2的极差分析结果可以看出，漆酶的用量是影响模型物产率的一个重要因素。因为在一定底物浓度下，漆酶用量的增加使得底物与活性中心的接触几率增加，进而反应速率和效率提高，但当酶浓度过大时，酶分子间会发生自聚，底物与酶活性中心的接触的几率缓慢增长直至趋于稳定。所以必须选择合适的用量，才既能保证反应快速高效的进行，又不至于造成酶的浪费。综上所述，选择漆酶用量为16.12IU?g?1。

3.3.2温度对产率的影响从表2的极差分析结果可以看出，温度对反应产率有一定的影响。一方面，升高温度可以提高酶的反应活性，增加底物分子的热能，从而有利于反应的进行。另一方面，温度的升高同样使得酶本身蛋白质结构的分子能增加，从而增加了多重弱的非共价键破裂的机会，使的酶的空间结构破坏，导致酶的失活[11]。综合上述因素，选择反应温度为40℃。

3.3.3pH值对产率的影响从表2的极差分析结果可以看出，pH对反应产率有较大的影响。这是因为只有在合适的pH内，漆酶才能保持正常的电离状态而具有较高的的生物活性，并且漆酶反应的最适pH因底物不同而不同。考虑到本反应中pH可能发生变化而影响漆酶的反应活性，因此使用pH4.5的磷酸盐-柠檬酸缓冲液进行试验。3.4稳定性试验通过上述试验可以得出合成模型物的最佳工艺条件为：漆酶用量16.12IU?g?1，反应温度40℃，反应的pH值为4.5。在此条件下，三次重复试验的结果如表3所示。从表3可以看出该合成工艺的稳定性较好，得率在77.9%~78.3%，平均得率为78.1%。

4结论

以香草醛为起始物，用漆酶催化合成了脱氢香草醛，并用硼氢化钠将其还原为联苯型木素模型物(5-5’结构)，产物结构通过FT-IR和1H-NMR分析得到了表征。通过工艺条件优化试验得到漆酶法合成脱氢香草醛较佳的工艺条件为：漆酶用量16.12IU?g?1；反应温度40℃；反应pH值4.5；反应时间5h。在最佳条件下合成脱氢香草醛的得率为77.9%~78.3%。与传统的方法相比，漆酶催化合成联苯型木素模型物具有条件温和、专一性强、得率较高、反应过程易于控制等优点，适合实验室合成。