木素结构NMR研究发展

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摘要：由于木素结构的复杂性，近年来出现了各种研究木素结构的新方法。本文主要阐述了13C-nmr及31P-NMR在木素结构研究中的进展。简单介绍了1H-NMR、19F-NMR、29Si-NMR在木素结构研究中的应用。

关键词：13C-NMR31P-NMR木素结构

木素是植物的主要成份之一，它是由苯基丙烷结构单元组成具有三维空间结构的复杂高分子聚合物。不同植物的木素其结构有所不同，不同处理方法所得同一植物木素其结构也常有差异。由于木素结构的多样性、复杂性和易变性，使其结构研究成为科学工作者长期探索的课题。木素结构研究方法众多，有化学分析法、紫外光谱法、红外光谱法及核磁共振氢谱等仪器分析方法，对木素组成及某些官能团的特征研究有着重要作用。然而，由于13C-NMR可以测定同一分子中处于不同化学环境的碳原子的化学位移，因而可以准确、快速地了解木素分子的细微结构，从而成为研究木质素结构的主要手段之一。自从Nimz等运用13C-NMR方法研究木质素结构以来，应用13C-NMR技术研究不同植物木质素结构日益广泛，从而使人们对木素的认识更为深刻[1]。31P-NMR光谱由于其能定量研究木素中存在的各种官能团，使得其在木素定量研究中变得普遍。

因此迄今为止，使用最多的核磁共振法是13C-NMR和31P-NMR，近年来亦有29Si-NMR,31P-NMR和19F-NMR研究木素和碳水化合物的功能基。本文主要介绍13C-NMR及31P-NMR在木素结构研究中的进展，对其它的NMR只做简单的介绍。

11HNMR谱在木素结构化学中的应用

1H-NMR法侧定对象是含H的化合物，因此木素和碳水化合物都可进行1H-NMR分析。根据不同位置的H具有不同的化学环境，在图谱中不同化学位移(δ)出现共振峰而进行定性分析，峰面积与H原子数成比例，从而也可进行定量分析。化学位移范围为δ＝0～9ppm。

1H核自然丰度为100,核旋磁比大,共振信号峰强,分析时间短,用样量少,这是1HNMR技术的优点，但由于它分辨率低而变得不受欢迎。现在1HNMR谱仅用于分析低分子量的木素产品。

213CNMR谱在木素化学中的应用

相比1H-NMR谱,13CNMR技术有很大优越性。13C-NMR法直接反映C原子所处的化学环境。13C的自然丰度只有1.108％，（12C的自然丰度为98-89,’H的自然丰度99.85％)，因此测定时灵敏度低，但可用脉冲核磁共振加傅利叶变换法提高其灵敏度13C-NMR有许多优点:(1)各种有机物都含C原子；(2)不同13C的化学位移变化范围大(0～220ppm)；(3)化学环境稍有不同的13C核都有不同的化学位移值[2]。

相对于1HNMR谱,使用频率对于13CNMR谱信号加宽受到影响较小,因为在相同场强下13CNMR谱占有比较宽的频率范围(13C约为1H的20倍),因此13CNMR的分辨率高。即使考虑偶极作用谱线变宽这个原因,13CNMR分辨率还是高。13CNMR可以利用去偶技术,消除自旋偶合,得到纯的13C谱,它比较简单,干扰少,可以得到整个碳骨架结构信息。此外,谱线变宽正比于核磁矩平方,(13C磁矩约为1H磁矩的1/4);同时,碳核处在大分子骨架中,碳周围质子屏蔽了中间分子的偶极作用,这更进一步促进13C信号峰明显窄于1H信号峰。由于以上这些原因决定13CNMR谱研究木素有比较高的效果。在木素结构研究中13CNMR谱实际上已取代了1HNMR[3]。而且13C的丰度可以通过同位素示踪的方法得到弥补[4～10]。

2.1　固体13CNMRCP/MAS方法在木素化学中应用

CP/MAS方法是获取固体高分辨核磁共振谱的最有效方法,该法用于木素研究中。所谓CP/MAS是交叉极化序列(CP)和魔角变换技术(MAS)的结合,前者能克服固体核磁共振谱信号弱的缺点;后者以魔角(54.7°)来旋转试样可以使宽信号峰变成清晰的尖峰。虽然固体的木素13CNMR谱的分辨率弱于液体的13CNMR分辨率,但是这个方法的绝对优越性是能在对木素样品不采取任何化学或机械处理的情况下对其进行测定。用这个方法实际能研究不溶于任何有机溶剂的样品。此外,有可能得到固体殊相互作用的信息和分子动力学等方面的信息。考虑化学方法测定木素时,部分木素溶解产生了复杂测况,特别是部分木素结构点阵被破坏这种情况。而CP/MAS方法避免了这种可能,它是直接测木材、纸浆中木素含量快速方便的方法。在木素的研究中经常用到固体13CNMR[5,8,9,11]。

2.2带13C标记的木素前驱物在研究木素结构中的应用

为了区别于分离木素一般称存在于细胞壁中的木素为原生木素，原生木素是在多糖存在的环境下由木素单体通过不可逆的方式聚合而成。木素单体和多糖随着细胞年龄和种类而变化，木素又与多糖通过物理化学的方式结合在一起。因此，将木素从细胞壁中分离出来而又对其三维非均匀立体结构不产生影响是不可能的。

在木素化学中经常用磨木木素来进行研究，而磨木木素被认为是从次生壁中分离出来的。它的最高得率不到细胞壁中原生木素的一半，而且其中还有相当数量与木素紧密结合在一起的碳水化合物。通常用来研究木素结构的方法是各种降解分析方法。首先将木素氧化、降解或溶剂分解成单体、二聚体或者寡聚物等片断，然后再测定这些片断的结构和得率。木素的各种结构都是在基于对这些低分子量物质的认识的基础上提出来的，而所有低分子量的得率总和不到40％，超过一半的木素高分子量物质不能被这种降解方法所分析到。

原生木素的这种特点使得对其结构的研究变得困难，用放射性和稳定同位素示踪法可以克服上述方法所带来的困难，因为它在不将木素从细胞壁中分离出来的同时就可以提供有关原生木素结构的信息。通过放射性同位素14C和3H的使用，细胞壁中各形态区域非均匀木素的结构和分布都得到了研究。然而，放射性同位素示踪法不能提供有关被同位素标记的碳和氢所处的化学环境的直接信息。用13C强化并结合固体NMR可以提供有关原生木素化学结构的信息而不用将其从细胞壁中分离出来。各种植物中某一被13C选择性强化的原生木素可以通过将带13C标记的前驱物注入到该植物中获得。NoritsuguTerashima[4]等人通过分别将在α，β，γ位带13C标记和未带标记的松柏醇葡萄糖苷注入到正在生长的银杏树体内来获得带13C标记的愈疮木基苯丙烷单元。对木质部中含有13C标记的木素进行NMR分析，并用带13C标记木素的NMR谱图减去未带标记木素的NMR谱图得到细胞壁中整体木素侧链碳得到增强的谱图，在各种条件下测定信号强度并考虑到各种标准的不确定性，可以得到木素内部各主要键的连接情况。

用13C-NMR研究木素结构时，由于天然木素13C丰度很低以及各碳原子之间信号的相互重叠使得分析木素结构变得困难。为了克服这一困难，谢益民等将带有13C标记的松伯醇葡萄糖苷注入到正在生长的银杏树体内，得到带13C标记的木素，其13C丰度为天然木素的3.5倍，通过分析α-C信号得到增强的13C-NMR谱图，说明了银杏木素的结构，而且通过高分辨固体13C-NMR分析，发现了银杏原生木素中存在着α-羰基和β-O-4结构[5]。将带有13C标记的紫丁香基前驱物注入到夹竹桃体内，分析了夹竹桃木素的结构[6]。将带13C标记和未带标记的松柏醇葡萄糖苷注入到稻杆体内得到13C丰度为天然稻杆体内10倍的木素，而且所得到的带标记和不带标记的NMR谱图基本没有差别。将得到的木素分别进行已酰化和酶降解得到有关稻杆木素结构的信息。这些都说明13C标记结合NMR技术可以用来分析稻杆细胞壁中的木素[7]。

顾瑞军[11]等以侧链α位带13C同位素标记的松柏醇葡萄糖苷作为起始物,在实验室中模拟木质素生物合成过程人工合成脱氢聚合物(DHP),得到带13C标记的DHP。用高分辨率固体13CNMR和红外光谱对DHP进行了分析。红外分析结果显示:该实验条件下用松柏醇葡萄糖苷合成的DHP同天然银杏木材的磨木木质素(MWL)在组成和结构上有较好的相似性。13CNMR证明了β-O-4、β-β、β-5和松柏醇结构为DHP的主要结构,另有少量香兰素结构和α位亚甲基结构。

当然，由于木素与碳水化合物以化学

键的方式连接在一起形成木素－碳水化合物复合体（LCC），因此我们在上述研究木素结构的同时也可以借助NMR谱图来分析LCC的结构[8～9]。由于在苯基丙烷单元侧链带有13C标记的松柏醇葡萄糖苷等木素前驱物只能分析木素中含有β-O-4’,β-5’,β–β’，α-O-4’等木素结构，因此Noritsugu[10]等在以前研究木素的基础上合成了苯环4位5位带13C标记的松柏醇葡萄糖苷，将其投入正在生长的植物体内可以分析5－5’,4-O-5’等木素中存在的键型。

2.3带13C标记的木素前驱物在研究木素－碳水化合物复合体结构中的应用

从20世纪80年代开始，人们试图用13C-NMR分析法研究木素结构及木素－碳水化合物之间的连接键，但由于木素大分子和碳水化合物的成分相当复杂，从一般的13C-NMR图上很难分辨出木素和碳水化合物之间的链接，从而要结合一些特殊的分析方法入13C同位素示踪法，这样就可以确定木素和碳水化合物两种大分子之间起架桥作用的化学键的形态，并可进一步定性或定量地分析木素侧链碳原子上LC键的比例。通过对松柏醇葡萄糖苷的外源性同位素标记可以有效地进行木素生物合成地研究，并探讨木素以及LCC地化学结构。

顾瑞军[12]等以侧链α位带13C同位素标记的松柏醇葡萄糖苷作为起始物,在实验室条件下模拟木素生物合成过程中木素—碳水化合物(LCC)复合体的生物合成过程,得到带13C标记的DHP和综纤维素复合物(DHPHC)。用高分辨率固体13C-NMR和红外光谱对DHPHC进行分析。红外分析显示:该实验环境下用松柏醇葡萄糖苷合成的DHPHC同天然银杏木材木粉在组成和结构上很相似。13C-NMR证明了木素结构单元在α位与碳水化合物主要以醚键和酯键连接。

331PNMR谱在木素结构化学中的应用

近年来开始利用31P-NMR测定碳水化合物及木素的功能基(羟基、羧基、羰基和醌基等)。31P的自然丰度是100,31P-NMR测定的灵敏度高，因此,它是一种可用核磁共振技术分析含磷化合物结构的理想的原子核。只要将碳水化合物和木素都转变为含磷的衍生物就能进行31P-NMR分析。近年来,由Argyropoulos等人成功将此技术应用于木素结构分析。

含有不稳定氢的化合物(如含有OH,SH和COOH等基团)与磷化试剂反应生成含磷的衍生物来标记这些活泼中心,然后用31P-NMR光谱技术进行测定。对于木素,具有这些不稳定氢活泼中心的基团有酚羟基(Ph-OH),脂肪羟基(aliph-OH),羧基(COOH),醛基(CHO)等反映木素结构特征的官能团。当这些基团与磷化试剂反应后,其衍生物的磷31核磁共振谱图的化学位移处在明显不同的区域。由于衍生物中磷原子周围都是氧原子,因此31P-NMR的信号都是无偶合的单峰,并且这种31PNMR核磁共振没有NOE效应,对于定量测定官能团极有利。这样就能够对木素中这些重要的基团用磷化物标记后进行定量测定[13]。

3.131PNMR光谱分析制浆漂白过程中的木素

Argyropoulos研究山毛榉经蒸汽爆破法处理溶出的木素,利用31PNMR光谱技术测定紫丁香型酚羟基是愈疮木型酚羟基的两倍,而总的紫丁香基与愈疮木基的比例为0.89,说明了紫丁香型结构优先游离出酚羟基。Robert用其它方法研究同类木素时,指出蒸汽爆破法会导致紫丁香基结构的β-O-4连接优先断裂,两者结果相一致。β-O-4结构是木素中的主要连接键,此结构在木素C9单元的比例反映出木素的聚合度。Sun[14]等人研究臭氧、二氧化氯、DMD及过氧化氢处理碱残余木素,利用31P-NMR技术可以准确测定其木素的羧基、酚羟基及β-O-4醚键的断裂情况。Argyropoulos[15]用31P-NMR技术测定MILOX制浆过程中木素结构特征的变化。在MILOX过程的第一阶段得出的愈创木型酚羟基多,表明此过程愈创木基木素优先溶出,主要是由于愈创木素富集的胞间层木素具有更大的可及性。

3.2固体31PNMR核磁共振光谱

对于纸浆,特别是磨木浆和机械浆,其木素结构中含有醛基、邻醌或对醌,α、β不饱和羰基和羧基等结构。如果将木素分离出来,这些基团容易发生变化,测出的结果不能反映浆中木素的真实特征。利用亚磷酸三甲酯可以与上述基团反应生成磷酸酯的衍生物,其固体31PCP/MASNMR光谱的信号具有特征的化学位移。Lebo和Lonsby利用此反应测定机械浆中的邻醌基团(由光诱导所产生)[13]。

Argyropoulos用亚磷酸三甲酯处理磨木浆(SGW)后测定固体31PCP/MASNMR光谱,发现在δ=10处有一个强宽峰,这是邻醌的磷酸酯衍生物重排后产物引起的。

3.331PNMR光谱在木素结构分析中的其它应用

LeonidG.Akim[16]等人用31P-NMR光谱分析从各基因改良后的树木中获得的木素，通过测定其中的游离酚羟基来分析经改良后各树木中木素结构的差别。由于31P可以用来测定木素中含有不稳定氢的基团如酚羟基(Ph-OH),脂肪羟基(aliph-OH),羧基(COOH),醛基(CHO)，ClaudiaCrestini等在此理论基础，研究了稻草木素结构中的醚键。通过将温和的碱性降解与31P-NMR结合起来可以分析各种醚键结构及它们各自在整体稻杆木素中的分布情况[17]。DimitrisS.Argyropoulos等[18]利用31P-NMR提出了半定量研究分离木素中邻醌与对醌的量的方法。M.ZAWADZKI[19]等也利用31P-NMR谱测定了分离木素中的醌的量，并指出浆料中的木素经氧化和CLO2漂白后，醌的结构会增加，而经过CLO2漂白后残余木素中醌的结构会减少。Shin-ichiroTohmura[20]等利用31P-NMR谱定量测定和检测了针叶材硫酸盐法制浆残余木素和磨木木素中的各种醚键，此外还提供了与缩合型和非缩合型苯环相连接的β芳基醚键的有关信息。并发现大部分的β芳基醚键在经过硫酸盐法制浆后都断开了。

P.Malkavaara,R.Alen和E.Kolehmainen[21]将13C-NMR和31P-NMR谱结合起来分析了针叶木和阔叶木硫酸盐法制浆所得黒液中各种酚羟基与脂肪羟基的含量，并在分析的基础上提出了预测黒液燃烧性能的模型。

419FNMR谱在木素结构化学中的应用

19F与31P一样，自然丰度为100,19F-NMR谱的化学位移范围宽。木素的氟衍生物

的稳定性好，同时氟原子在芳环上的位置对化学位移非常灵敏，容易得到各种羟基的信号，特别是可以测定羧基的含量，这些都是19F-NMR的优点[2]。

BehazadC.Ahvazi,Claudia[22]等利用19F-NMR对木素中存在的羰基进行了检测和分类，证明了所使用的方法可以用来定量分析可溶性的原生和改良木素。

529SiNMR谱在木素结构化学中的应用

RobertBrezny首先报道了用29Si-NMR法测定多种模型物的三甲基硅醚衍生物的结构29Si的自旋量子数I＝1/2，其自然丰度4.7％，因此，29Si-NMR的测定灵教度很低，但是可以用常规的INEPT技术使三甲基硅醚衍生物中29Si的信号放大。29Si-NMR主要用于研究能引进Si原子的一OH,-COOH基团和可以烯醇化的羰基。用硅醚化试剂使这些基团醚化，引进Si原子，即可用”Si-NMR进行分析，因而可以用于研究木素和碳水化合物的功能基[13]。

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