消痰和胃方对胃癌前病变大鼠细胞凋亡的影响

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摘要：目的 观察消痰和胃方对胃癌前病变大鼠胃黏膜细胞Caspase-3表达及凋亡指数的影响，探讨该方干预胃癌前病变的机制。方法 采用化学干预为主的多因素造模法制作胃癌前病变大鼠模型。实验大鼠随机分为正常组、模型组、维酶素组、消痰和胃方组，各组给予相应药物灌胃。干预6周后，免疫组化检测大鼠胃黏膜细胞Caspase-3的表达，TUNEL法检测大鼠胃黏膜细胞凋亡指数。结果 与正常组比较，模型组胃黏膜细胞Caspase-3水平和凋亡指数明显降低（P

关键词：胃癌前病变；消痰和胃方；凋亡指数；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.04.014

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）04-0054-03

Effects of Xiaotan Hewei Formula on Cell Apoptosis of Precancerous Lesions of Gastric Carcinoma Rats ZHANG Xuan， XU Jing-yu， SUN Da-zhi， QIN Zhi-feng， LI Yong-jin， SHI Jun， TANG Ji-gui， ZHANG Ying-cheng， WEI Pin-kang （Department of Traditional Chinese Medicine， Changzheng Hospital Affiliated to Second Military Medical University， Shanghai 200003， China）

Abstract： Objective To investigate the effects of Xiaotan Hewei Formula on the Caspase-3 expression and apoptosis index of precancerous lesions of gastric （PLGC） rats； To explore potential mechanism of intervention on PLGC. Methods The rat model of gastric precancerous lesion was made by multi-factor modeling with chemical intervention primarily. The rats were randomly divided into normal group， model group， Vimentin group， Xiaotan Hewei Formula group. Each administration group was given the corresponding medicine for gavage. After 6 weeks of intervention， the expression of Caspase-3 in gastric mucosa was detected by immunohistochemistry. The apoptosis index of gastric mucosa was detected by TUNEL method. Results Compared with the normal group， the level of Caspase-3 and the apoptosis index of gastric mucosa cells in the model group were significantly lower （P

Key words： precancerous lesions of gastric carcinoma； Xiaotan Hewei Formula； apoptosis index； Caspase-3； rats

胃癌是常的恶性肿瘤，严重威胁人类的生存，其发病率及死亡率较高。胃癌前病变（precancerous lesions of gastric carcinoma，PLGC）的防治是胃癌二级预防的重要内容[1]。逆转PLGC成为了胃癌防治的有效措施之一。目前西医治疗PLGC的特殊药物及手段并不完善，而中医药的优势则较为明显，不仅能改善患者的临床症状，还可逆转PLGC[2]。因此，中医药防治PLGC已逐渐受到业界的重视，其中胃黏膜细胞凋亡紊乱在PLGC的发生发展中扮演了重要角色。消痰和胃方是我院临床经验方。本研究观察消痰和胃方对PLGC大鼠胃黏膜细胞Caspase-3水平及凋亡指数的影响，初步探讨其作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

清洁级Wistar雄性大鼠，6周龄，中国科学院上海试验动物中心，动物许可证号SCXK（沪）2012- 0002。饲养于第二军医大学药学院清洁级开放式动物房。

1.2 药物

消痰和胃方，方中饮片均购自上海雷允上中药饮片公司，第二军医大学附属长征医院制剂室水提醇沉制成浸膏；维酶素片，新乡恒久远药业有限公司，批号20120102；N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍（MNNG），日本东京化成工业株式会社。

1.3 主要试剂与仪器

水合氯醛、伊红染液、10%中尔马林固定液、梯度乙醇及二甲苯，第二军医大学药学院；鼠抗人 Caspase-3单克隆抗体，英国Abcam公司；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司。电子秤，寺冈电子有限公司；石蜡切片机，德国Leica公司；光学显微镜，日本Olympus公司；高温烘烤箱，德国Heraens 公司；高速冷冻离心机，德国Kendro实验仪器公司；低温冰箱，海尔公司；紫外分光光度计，上海谱元仪器有限公司。

2 实验方法

2.1 造模

参照文献[3]方法并加以改进。300 μg/mL MNNG溶液灌胃，同时予无水乙醇灌胃，3 d灌胃1次，进食2 d后禁食1 d。夹尾时间为每周三9：00，保持大鼠争夺激怒状态10 min，连续32周。胃黏膜组织病理学改变判断标准参照文献[4]。

2.2 分组和给药

成模大鼠随机分为模型组、维酶素组、消痰和胃组，分别为11、13、14只。另取14只大鼠作为正常组。根据人和动物体表面积折算等效剂量比值简表进行人口服中药剂量与鼠灌胃中药剂量换算，得出各组大鼠所需灌胃剂量。正常组和模型组给予生理盐水灌胃，维酶素组给予维酶素悬浊液灌胃，消痰和胃组给予消痰和胃方浸膏灌胃。给药体积均为1 mL/100g体质量，每日1次，连续6周。

2.3 标本收集

6周后，所有大鼠禁食不禁水24 h，水合氯醛腹腔注射麻醉，剑突下沿腹中线剪开，将胃部与周围组织分离，沿胃大弯纵向切开，去除胃内容物，取胃大弯处胃黏膜组织，福尔马林固定，常规石蜡包埋，切片。

2.4 免疫组化检测Caspase-3表达

将石蜡切片置于60 ℃烤箱烘干过夜；3%H2O2室温孵育，将内源性过氧化物酶灭活；微波修复抗原；加入稀释的抗Caspase-3抗体及生物素标记的二抗，室温孵育，PBS反复冲洗；加入用辣根酶标记的链霉卵白素，室温孵育；DAB显色；苏木素衬染，0.1%盐酸酒精分化，自来水反复冲洗至返回蓝色；常规脱水，透明，中性树胶封片。免疫组化积分标准：按阳性细胞所占百分比计0分（75%），再按染色强度计0分（无色）、1分（淡黄色）、2分（棕黄色）、3分（棕褐色），二者相乘为积分结果。记录各组分值并统计阳性表达细胞数，计算积分均数。

2.5 TUNEL法检测细胞凋亡

采用TUNEL法检测常规处理的胃标本石蜡切片，实验步骤按照试剂盒说明严格执行。凋亡细胞的判断标准为细胞核中出现棕黄色颗粒，5个高倍镜下细胞个数均>1000，统计凋亡细胞数和总细胞数。计算凋亡指数（AI）。AI（%）=凋亡细胞数÷总细胞数×100%。

3 统计学方法

采用SPSS18.0统计软件进行分析。计量资料以―x±s表示，多组间比较采用方差分析，组间比较采用LSD-t检验，等级资料多组间比较用非参数秩和K-W检验，分组比较采用WILCOXON秩和检验。P

4 结果

4.1 消痰和胃方对模型大鼠胃黏膜细胞Caspase-3蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组Caspase-3水平明显降低（P

4.2 消痰和胃方对模型大鼠胃黏膜细胞凋亡指数的影响

与正常组比较，模型组AI值明显降低（P

5 讨论

PLGC是指一类胃黏膜的病理学改变，与胃癌密切相关。同时也是胃黏膜在多种致癌诱因作用下向胃癌演变过程中的一个重要阶段。此阶段的标志通常是胃黏膜细胞出现异型增生，成为胃癌发生的重要组织病理学基础[5]。

凋亡作为细胞程序性死亡的重要方式，其介导和执行作用是通过Caspase家族实现的。目前研究显示，Caspase-3作为家族中最重要的凋亡执行者，是细胞凋亡的关键酶，它在众多凋亡信号传导途径中起着重要作用[6]。Caspase-3同时也是多种凋亡信号汇集的终点，它的活化表明凋亡不可逆转[7]。

我院魏品康教授提出“痰”是PLGC的核心病机思想[8]。宏观上痰湿内壅，困阻中焦脾胃，出现饱胀纳差、呕恶疼痛等症状，病程缠绵、反复难愈；微观上各种致病因素导致的病理产物可归于中医痰浊范畴，痰浊浸淫胃黏膜细胞，诱导细胞恶变，逐渐成为胃癌细胞[9]。因此，阻断PLGC的进程，可以预防胃癌的发生，这也是中医“治未病”思想的具体体现。

消痰和胃方由柴胡、制半夏、茯苓、黄连、白花蛇舌草、蒲公英、桂枝、制大黄、白芍、炙甘草等组成[10]。方中柴胡、制半夏相伍，共为君药，苦辛温燥，痰气并治；臣以茯苓、黄连、白花蛇舌草、蒲公英，健脾祛湿、清热解毒；桂枝温通经脉，制大黄通闭逐瘀，共为佐药；炙甘草与白芍酸柔甘守，化生胃阴为使。

本实验采用以化学损伤为主的多因素方法建立PLGC大鼠模型，结果表明消痰和胃方可提高PLGC大鼠胃黏膜细胞Caspase-3表达和凋亡指数，促进细胞凋亡，恢复增殖与凋亡的动态平衡，起到逆转PLGC胃黏膜病理状态，防止向胃癌的进一步演变的作用。

参考文献：

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[10] 张璇，徐晶钰，秦志丰，等.从痰论治胃癌前病变临证思路[J].中国中医药信息杂志，2014，21（3）：99-100.