露花微繁技术体系研究

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摘要：以温室中生长的露花（Mesembryanthemum cordifolium L. f.）幼嫩茎段为外植体，利用正交试验等方法研究了露花微繁技术体系。结果表明，用70%～75%乙醇浸泡30 s、0.1%升汞浸泡6 min对外植体消毒灭菌就能达到理想的效果；对于无顶芽茎段，丛生芽增殖最适培养基是MS+NAA 0.05 mg/L+6-BA 0.9～1.5 mg/L+GA3 0.3 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L；而对于有顶芽茎段要达到相同增殖预期，则在其他成分不变的前提下，需要6-BA浓度达到1.5 mg/L。因此，无顶芽茎段更适合作为丛生芽增殖的培养材料；生根最适培养基是1/2 MS+IBA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L。

关键词：露花（Mesembryanthemum cordifolium L. f.）；组织培养；微繁技术；丛生芽增殖

中图分类号：S649.1+2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）14-3657-05

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.14.029

Abstract： Using the tender stem growing in greenhouse as explants， orthogonal test was applied to study the micropropagation technique system of Mesembryanthemum cordifolium L. f.. The results showed that dipping in 70% to 75% alcohol for 30 s and 0.1% mercuric chloride for 6 min would had idea sterilization effect. For tender stem without terminal bud as explants， the optimal medium for clump bud proliferation was MS+0.05 mg/L NAA+0.9 to 1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L GA3+30 g/L sugar+7 g/L agar； while for tender stem with terminal bud， the 6-BA concentration should be 1.5 mg/L. Therefore， tender stem without terminal bud was more suitable explants for clump bud proliferation. The optimal medium for rooting was 1/2 MS+0.2 mg/L IBA+30 g/L sugar+7 g/L agar.

Key words：Mesembryanthemum cordifolium L. f.； tissue culture； micropropagation technique； clump bud proliferation

露花（Mesembryanthemum cordifolium L. f.）又名心叶日中花、露草、花蔓草、牡丹吊兰、樱花吊兰、太阳玫瑰等[1，2]，为番杏科（Aizoaceae）日中花属（Mesembryanthemum L.）多年生常绿草本植物，原产于非洲南部，现在国内多地都有栽培，通常栽培供观赏，是去除甲醛效果较好的常见居室观赏植物之一[3]；近些年也作为蔬菜食用[1，4，5]，俗称田七菜、食用穿心莲；同时作为兼性CAM植物常被用于生理研究[6-8]。生产上常采用分株、扦插、播种等方法繁殖[1，2，9]；国内自匡安秀等[10]首次报道露花通过幼茎、叶片诱导愈伤组织分化出根与芽进行离体培养以来，陈香波等[11]、王小红等[12]也对露花的组织培养及植株再生技术进行了探讨，都为露花的组培快繁奠定了基础。本试验以露花幼嫩茎段为外植体，在消毒方案筛选与初代培养、丛生芽增殖、试管内生根苗炼苗移栽等方面进行了探索，初步确立了露花微繁技术体系，不仅为其快速生产找到了新的途径，也为其生理生化研究带来了便利。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料露花来自河南农业职业学院科技园日光温室；2012年10月下旬，剪取生长旺盛的露花幼嫩茎段，迅速带回实验室。

1.2 方法

1.2.1 外植体消毒与初代培养 在实验室将露花幼嫩茎段去叶留茎，流水缓慢冲洗1 h，去离子水漂洗3次后带入无菌操作室，在超净工作台上用70%～75%乙醇浸泡30 s，迅速用去离子水漂洗2次，将水沥干；再用0.1%升汞（每升加1滴吐温80）分别浸泡6、8、10、12 min，去离子水漂洗4次，最后用无菌滤纸吸干残留水分。在无菌条件下将消毒灭菌后的材料剪成1.5 cm左右长的茎段，接种在琼脂含量为7 g/L（下同）的固体MS培养基[13]上培养，培养基pH 5.6～6.0（下同）。培养条件为：温度25 ℃±2 ℃，光照度2 000～3 000 lx，光照时间12 h/d，培养室相对空气湿度70%左右。2周后统计污染率、未萌芽率和萌芽率[14]。

污染率=（污染外植体数/接种外植体数）×100%，

未萌芽率=[（死亡外植体数+未萌芽外植体数）/接种外植体数]×100%，

萌芽率=（萌芽并且没污染外植体数/接种外植体数）×100%。

1.2.2 芽继代增殖培养 ①L9（34）正交试验筛选芽增殖配方。以固体MS培养基为基本培养基，进行4因素3水平正交试验[15]，各因素、水平组合见表1。采用初代培养中生长旺盛、健壮一致的无菌绿苗，取有顶芽带2对叶片的茎段分别接种于9组培养基中培养，每组试验做5次重复。4周后统计芽增殖系数，，取5次重复的均值；试验中有效芽的苗长度不小于0.5 cm。芽增殖系数=有效芽苗数/接种芽苗数。②增殖配方中6-BA浓度的优化试验。分别取有顶芽带2对叶片与无顶芽带2对叶片的无菌茎段，接种于添加NAA 0.05 mg/L、GA3 0.3 mg/L、蔗糖30 g/L和不同浓度6-BA（0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mg/L）的固体MS培养基上。每组接种5瓶，每瓶接种4株，4周后统计芽增殖系数。

1.2.3 生根培养 以固体1/2 MS（即MS大量元素减半，其他正常）培养基为基本培养基，添加不同浓度的IBA（0、0.2 mg/L）进行生根试验。采用有顶芽带3对叶的茎段进行接种，每组接种5瓶，每瓶接种4株。2周后统计生根率、生根数和根长。生根数指根长大于或等于0.2 cm的根数量。

生根率=（生根苗数/接种苗数）×100%。

1.2.4 炼苗移栽 2013年9月13日开始，在温室内对苗高不低于3 cm、生根数不少于2条、根长不小于0.5 cm的组培苗进行炼苗。先闭瓶炼苗0、14 d，然后开口加少量自来水炼苗3 d（每天都要更换自来水），准备移栽。移栽时先用自来水洗净根上的培养基，在50%多菌灵可湿性粉剂600～800倍溶液中浸根10 min，然后移栽入事先装有基质（草炭∶蛭石∶珍珠岩=1∶1∶1，已经混合均匀并加适量水调好基质含水量65%左右）的营养钵中，浇透水（也可用多菌灵溶液浇灌），盖上小拱棚（也可放入能严格控制湿度的大玻璃槽箱中）。炼苗期间和移栽初期7～10 d内，控制温度20～30 ℃，遮光，相对空气湿度保持在90%以上，并保持适当透气性。10～15 d后撤去拱棚，做好日常管理。移栽3周后统计移栽成活率。

移栽成活率=（移栽成活苗株数/炼苗株数）×100%。

1.3 数据处理

试验所得数据采用Microsoft Office Excel 2003和SPSS 9.1软件处理、制表，并做方差分析；利用邓肯氏新复极差检验法（Duncan's new multiple range test，DMRT）进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同消毒时间对露花外植体初代培养的影响

试验设定的不同消毒时间对露花外植体萌芽率的影响情况见表2和图1。由表2和图1可知，在0.1%升汞中浸洗6、10、12 min的萌芽率最高，均为93.75%；尽管在0.1%升汞中浸洗8 min处理的萌芽率略低，但与6、10、12 min处理的萌芽率差别不大。说明在10月下旬剪取的温室内露花幼嫩茎段含菌少、易消毒、易萌芽，用70%～75%乙醇浸泡30 s、0.1%升汞浸泡6 min即可达到理想的消毒灭菌效果。

2.2 芽增殖培养

2.2.1 芽增殖配方的L9（34）正交试验筛选 试验过程中露花外植体萌芽后生长迅速，接种2 d后，各组植株就已开始生长。接种28 d时芽增殖情况见表3和图2。由表3分析可见，有顶芽带2对叶的茎段芽增殖系数产生高低的顺序是6-BA、蔗糖、NAA、GA3，方差分析结果表明，6-BA浓度表现差异显著，NAA、GA3与蔗糖均不显著，4个因素NAA、 6-BA、GA3、蔗糖引起平均芽增殖系数最高的水平依次是2、3、3、2。因此，MS+NAA 0.05 mg/L+6-BA 0.9 mg/L+GA3 0.3 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L就是正交试验中最适的芽增殖培养基配方。在正交试验中，6-BA的浓度表现差异明显，并且芽增殖系数随着6-BA浓度的增加（0.3、0.6、0.9 mg/L）而明显增大，因此，笔者又探讨了不同6-BA浓度对芽增殖的影响，并采用有顶芽与无顶芽茎段作为培养材料，比较了二类茎的芽增殖情况。

2.2.2 芽增殖配方中6-BA浓度的优化 试验发现在接种2～3 d，各组植株就开始生长。有顶芽带2对叶片的茎段先是顶芽伸长、新叶长大，接种7 d开始萌发腋芽，接种14 d腋芽已明显伸长；而无顶芽带2对叶片的茎段在接种3～5 d就开始有腋芽萌发，接种14 d多数腋芽明显伸长。接种28 d的芽增殖情况见表4。由表4可知，在相同配方上，有顶芽茎段的增殖系数均小于无顶芽茎段。对于接种有顶芽茎段的各配方处理而言，在6-BA浓度不小于0.9 mg/L时，芽丛（即丛生芽）才会出现，并在6-BA浓度为1.5 mg/L时芽增殖系数达到最高（平均芽增殖系数为5.4，最多的可达10.0），并且显著高于其他水平（P

2.3 生根培养试验

对露花离体继代增殖材料进行生根培养的情况见表5和图3。从表5和图3可见，露花离体继代增殖材料生根比较容易，早的在生根培养5～7 d就可见白色根突，新发根大部分在茎基部产生。在培养14 d时，从生根率、平均生根数与平均根长方面考虑，1/2 MS+IBA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L培养基为露花离体继代增殖材料比较适宜的生根培养基配方。

2.4 炼苗移栽

对露花生根培养苗进行炼苗的情况见表6和图4。由表6和图4可见，闭瓶炼苗时间对于露花生根培养苗移栽成活率没有明显的影响，因此，露花生根培养苗在开口炼苗3 d后就可以进行移栽，成活率可达96.7%以上。

3 小结与讨论

在植物组织培养过程中，供试材料的生长环境直接影响外植体的洁净程度和生理状态；切取外植体的供体植株生理状态，对于芽在培养条件中的响应能力有明显的影响。在植物生长季节开始时，由活跃生长的枝条上切取的外植体通常能产生最好的组织培养效果。若把供体植株种在温室或培养箱中，使它们持续在进行营养生长所需的光照和温度环境条件下，就有可能把茎芽对培养响应的季节性波动减少到最低限度[13]。选用温室中生长的露花幼嫩茎段，不仅相对洁净、染菌率较低[17]，而且即使在10月下旬室外为霜降节气时仍在活跃生长。试验结果表明，用70%～75%的乙醇浸泡30 s，去离子水漂洗2次，沥干水后再用0.1%升汞浸泡6 min，去离子水漂洗4次，则适宜对露花幼嫩茎段进行初代培养，易获得无菌培养材料。

诱导顶芽和腋芽成苗是一种“芽生芽”的增殖过程，获得的再生植株遗传性状稳定，增殖能力不易退化，是植物离体微繁中常用的增殖材料，其增殖途径主要分为通过单节茎段扦插实现芽增殖的无菌短枝型和通过增强腋芽生枝能力实现芽增殖的丛生芽增殖型[13，18，19]。试验结果表明，露花离体嫩茎既可以通过无菌短枝型增殖，也可以通过丛生芽增殖型增殖。在NAA浓度为0.05 mg/L时，若6-BA浓度较低（对于有顶芽茎段小于0.9 mg/L，对于无顶芽茎段小于0.6 mg/L）则植株以无菌短枝型增殖为主；若6-BA浓度较高（对于有顶芽茎段不小于1.2 mg/L，对于无顶芽茎段不小于0.9 mg/L）则植株以丛生芽增殖型增殖为主。可见，露花有较强的顶端优势，要打破顶端优势获得相同的丛生芽增殖预期，对于有顶芽茎段材料需要较高浓度的6-BA，而对于无顶芽茎段材料仅需较低浓度的6-BA，因此，建议采用无顶芽茎段作为丛生芽增殖培养材料。

当把小枝条放在一种含有适宜种类和适当浓度细胞分裂素的培养基（生长素或有或无）上时，则可增强腋芽的生枝能力，使枝条的繁殖系数显著提高[13]。露花芽增殖L9（34）正交试验结果表明，细胞分裂素6-BA浓度对露花芽增殖系数影响明显，而NAA、GA3与蔗糖浓度影响不明显。当细胞分裂素的水平较高时，形成茎芽的数目可能较多，但每个茎芽的生长会受到抑制，有时还要加入GA3以促使茎的伸长[13]。虽然GA3浓度对芽增殖系数影响不明显，但试验表明不加GA3的配方中增殖的芽茎较短密，而加有GA3的配方中增殖的芽茎较伸展。6-BA浓度的优化试验结果表明，培养露花有顶芽茎段时，MS+NAA 0.05 mg/L+6-BA 1.5 mg/L+GA3 0.3 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L是最适宜的丛生芽增殖培养基配方，其平均芽增殖系数（5.4）高于正交试验中筛选的最适配方MS+NAA 0.05 mg/L+6-BA 0.9 mg/L+GA3 0.3 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L（3.8）；培养露花无顶芽茎段时，MS+NAA 0.05 mg/L+6-BA 0.9～1.5 mg/L+GA3 0.3 mg/L+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂是最适宜的丛生芽增殖培养基配方，其芽增殖系数达到最高，平均芽增殖系数高达5.7（最多的可达12.0），高于陈香波等[11]的4.0，接近（或高于）王小红等[12]的6.2±2.8（最多的可达11.6）。试验进一步表明，培养露花无顶芽茎段时，较低浓度的6-BA有利于减轻玻璃化现象；但要完全抑制露花试管苗的玻璃化，需在MS培养基中不加NH4NO3[16]。

试验结果表明，露花适宜的生根培养基配方是1/2 MS+IBA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L。只要控制好温度、保持高湿度、遮阴避强光、注意基质的透气性，则露花炼苗移栽的成活率较高，可达96.7%以上。

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