清咽喉合剂微生物限度检查方法的验证
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【摘要】 目的 建立清咽喉合剂微生物限度检查方法。方法 按《中国药典》2010年版的规定， 采用常规法测定清咽喉合剂对五种验证菌株的回收率和对控制菌检查进行验证。结果 采用常规法， 细菌、霉菌及酵母菌的回收率均>75%， 并可检出大肠埃希菌。结论 经方法学验证， 可采用常规法进行清咽喉合剂微生物限度检查。
【关键词】 清咽喉合剂；微生物限度；验证
清咽喉合剂为中山大学孙逸仙纪念医院的特色中药制剂， 其主要由岗梅根、野、蒲公英三种中药材煎煮浓缩制成[1]， 具有清热、消炎、解毒作用。现根据《中国药典》2010年版（一部）[2]， 对清咽喉合剂微生物限度检查方法进行验证， 以保证测定结果的可靠性。
1 仪器与材料
1. 1 仪器 超净工作台（苏净集团安泰公司）、303A-1生化培养箱（上海浦东荣丰科学仪器有限公司）、SPX-100B生化培养箱（上海悦丰仪器仪表有限公司）。
1. 2 试药 营养琼脂培养基（批号：140308）， 玫瑰红钠琼脂培养基（批号：140228）， 营养肉汤培养基（批号：130521）， 改良马丁培养基（批号：1401222）， 改良马丁琼脂培养基（批号：130910）， 胆盐乳糖培养基（批号：1402132）， MUG培养基（批号：135012）， 曙红亚甲蓝琼脂培养基（批号：1310312）（以上均来源于北京三药科技开发公司）。清咽喉合剂（规格：100 ml， 批号：201312248， 201312258， 201312308， 中山大学孙逸仙纪念医院）。
1. 3 菌种 大肠埃希菌（escherichia coli） [CMCC（B）44 102]， 金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus）[CMCC（B）26 003]， 枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis） [CMCC（B）63 501]， 白色念珠菌（candida albicans） [CMCC（F）98 001]， 黑曲霉（aspergillus niger） [CMCC（F）98 003]（以上菌种的冻干菌均购自中国食品药品生物检定研究院）。
2 方法与结果
2. 1 菌液制备 分别接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌至营养肉汤培养基， 经35 ℃培养24 h， 取其培养物， 用0.9%无菌氯化钠溶液按10倍稀释至约50～100 cfu/ml的菌悬液备用。接种白色念珠菌至改良马丁培养基， 经25℃培养24～48 h， 取其培养物， 用0.9%无菌氯化钠溶液按10倍稀释至约50～100 cfu/ml的菌悬液备用。取2～8℃保藏的黑曲霉孢子混悬液， 稀释至约50～100 cfu/ml的孢子悬液备用。
2. 2 供试液制备 取供试品原液， 混匀， 作为供试液。
2. 3 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证
2. 3. 1 试验组 分别取供试液、试验菌液各1 ml， 注入同一平皿中， 立即倾注相应的不超过45℃的琼脂培养基， 待凝结后， 按规定培养， 点计平均菌落数。每株试验菌平行制备2个平皿。
2. 3. 2 菌液组 取试验菌液1 ml， 注入平皿中， 同“2.3.1”项下方法操作。
2. 3. 3 供试品对照组 取供试液1 ml， 注入平皿中， 也同“2.3.1”项下方法操作。
2. 3. 4 回收率计算 试验组回收率=×100%（规定：不低于70%）， 结果见表1。
由表1可见， 用1 ml/皿供试液时， 各菌株的回收率均可达到70%以上， 且3次均能重现试验结果， 因此本品的细菌、霉菌及酵母菌计数可用平皿法检查（即1 ml/皿）。
2. 4 控制菌检查方法的验证 本品为口服给药制剂， 控制菌应检查大肠埃希菌。大肠埃希菌检查法的验证：分别取供试液1 ml加至胆盐乳糖培养基100 ml中， 加入10～100 cfu大肠埃希菌， 按《中国药典》2010年版（二部）大肠埃希菌检查法进行验证。结果见表2。
由表2可见， 本品可用常规法检查大肠埃希菌。
3 讨论
研究表明[3， 4]， 岗梅根和野两种药材均对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌等有较强的抑制作用。清咽喉合剂由以上两种药材煎煮而成。实验结果表明， 采用常规法检查清咽喉合剂的细菌、霉菌、酵母菌数， 回收率均>75%， 控制菌大肠埃希菌可检出， 该法可为清咽喉合剂微生物限度检查的标准。
参考文献
[1] 伍俊妍， 李国成， 林晓珊， 等.清咽喉合剂质量标准的研究.中药材， 2008， 31（9）：1431-1433.
[2] 国家药典委员会.中国药典（一部）. 北京：中国医药科技出版社， 2010：附录XIII C.
[3] 何少璋， 张一萍， 喻丽元.岗梅对微生物的作用研究.现代医院， 2008（5）：12-13.
[4] 方静， 王德， 周学琴.野两种提取方式对5种常见细菌的抑菌效果的比较.数理医药学杂志， 2007， 20（3）：368-369.
[收稿日期：2014-06-12]