天然反义转录物生物学功能及意义
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随着基因表达加帽分析技术(CAGE),基因表达序列分析技术(SAGE)以及cDNA的大规模平行测序等高通量技术方法的发展,证实NATs在原核和真核基因组中是普遍存在的。在植物和动物基因组中,7%~30%的基因中存在NATs[12](表1)。在人和小鼠转录基因组中高达72%的转录本有反义RNA[10,13]。而且,很多NAT的数据库也已经建立起来了[4]。NATs长度通常在100到几千个碱基对。根据来源,NATs通常可以分为两类:顺式NATs(cis-NATs)和反式NATs(trans-NATs)[14]。cis-NATs与trans-NATs的主要区别在于转录来源。cis-NATs转录自靶基因的基因座的反链DNA,而trans-NATs转录自不同的基因座。因此,cis-NAT与靶基因序列完全互补(二者基因重叠),而trans-NAT由于不完全互补可以作用于许多不同的正义转录物,形成复杂的调控网络[15]。cis-NATs最早是在病毒中检测到的[16],接着在原核生物[17]以及真核生物[18]中相继发现。根据基因相对方位和重叠程度,cis-NATs分为头对头(5′到5′)、尾对尾(3′到3′)、完全重叠以及非重叠NATs[13,19](图1)。绝大多数基因组层次上的研究表明:尾对尾是最普遍的方式[4]。根据互补区域的编码潜能,NATs可以分为编码—编码、编码—非编码和非编码—非编码三类[11,14]。
NATs作用方式
NATs在生理以及病理过程中起重要作用,作用机理包括:基因组印记(genomicimprinting)、选择性剪切、X染色体失活、mRNA稳定性维持、翻译调节、RNA输出、DNA甲基化以及组蛋白修饰等[20]。基因组印记是一种是由亲本来源不同而导致等位基因表达差异的一种表遗传现象。这类印记基因约占基因组基因的1%,是哺乳动物和显花植物的独特现象。大部分印记基因都分布在印记基因簇内,其中包含大量的非编码RNA基因[21]。NATs还参与发育过程调控,对各种应激的适应和对病毒感染的响应[22]。NATs通过直接的反义–正义RNA相互作用,或通过编码与正义RNAs共表达的蛋白来调节正义转录物,从而调控正义RNAs的编码潜能[23]。反义转录物对正义转录物的影响表现在以下两个方面[24]:(1)不一致调节或反馈调节,反义转录物通过负性调节方式沉默或抑制同源正义RNAs或蛋白质;(2)一致调节或正反馈调节,正义和反义转录物共表达,反义转录物增加了正义RNAs水平或相应蛋白质水平[25]。
负反馈调节负反馈调节指反义转录物浓度下降导致正义转录浓度增加(图2)。例如在某些情况下为了刺激新生血管形成[26],通过G蛋白偶联受体CD97靶向其编码的反义配基DDX39最终获得增强的信号[4]。P15(CDKN2B)是一个肿瘤抑制因子,与正常淋巴细胞相比,白血病淋巴细胞含有较高浓度的p15反义转录物,但是p15本身浓度却很低,提示在白血病中p15与其反义转录物水平呈负相关[25]。这些结果提示,NATs的上调也许与肿瘤抑制基因非正常沉默密切相关,NATs可能通过相似方式又影响了其他基因。
正反馈调节正反馈调节方式是指:①单独靶向反义RNA导致正义mRNA下调;或②反义RNA和正义RNA同时下调,从而使常规的正义基因表达被附带或协同下调(图2)。转录因子Nkx2.2在神经干细胞分化成寡树突胶质细胞系中起重要定向作用。研究表明,Nkx2.2的NAT过表达促进Nkx2.2mRNA水平适度增加,并增强了神经干细胞向寡树突胶质细胞系的分化的潜能[27]。参与对低氧分压的适应的缺氧诱导因子(HIF-1)是一个异二聚体转录因子,其亚基HIF-1a在非状透明细胞肾肿瘤中高表达,同时HIF-1a的NAT表达也上调[28]。Wrap53是p53的反义转录RNA,它可以靶向5′非翻译区,从mRNA和蛋白水平上增加内源性p53表达[29]。Liu等[30]发现了几个在早期成骨细胞分化中的NATs,这些NATs增强了干扰素诱导跨膜蛋白5(IFITM5)的表达和成骨细胞分化。鉴于这些正反馈调节,NATs被认为可能是一个潜在的治疗多种疾病的药物靶点。
NATs作用机制
NATs可能通过直接的与正义转录物相互作用,或通过对mRNA转录、突变、运输和翻译等靶点的影响来调节基因表达[20,27]。NATs的调节作用以双链RNAs为基础,其作用机制包括RNA编辑[31]、RNA干扰[32]、RNA封闭[33]和转录干扰[34]等。在某种生理刺激下,NAT的启动子也有一些转录因子结合位点[35],一些NATs和他们相应的正义转录物有可能互相竞争结合相同的转录因子,提示NATs和他们的正义转录物能共表达或成反比表达[36]。此外,DNA甲基化和/或组蛋白修饰也参与了基因表达调节[37]。因此,NATs与DNA甲基化和组蛋白修饰之间可能存在直接的联系。
RNA编辑靶向核编码RNA和病毒RNA双链区域的腺嘌呤脱氨酶(ADARs)是一类RNA编辑酶。这些酶在神经系统中含量丰富,可通过改变mRNA中的密码子,使基因组中编码信息多样化。ADARs在已知底物中的功能提示这些酶通过多种方式微调和优化很多生物通路。
RNA干扰反义RNA能够影响mRNA生物转化的最早期过程,包括调控染色体结构,转录起始和剪切等。在血管平滑肌细胞中,RNA干扰介导的一氧化氮合酶反义mRNA(sONE)的下调增加了内源性一氧化氮合酶(eNOS)的表达。内皮细胞中,过表达的sONE削弱了eNOS表达。结果提示,sONE参与了转录后eNOS的调节[27]。
RNA封闭RNA封闭就是由于反义RNA与正义RNA配对形成双链,封闭了正义转录物(pre-mRNA)的剪切位点,使pre-mRNA发生选择性剪接改变,或抑制了反式作用因子与pre-mRNA结合,最终导致靶mRNA运输、翻译抑制或降解。
转录干扰转录干扰是由于NATs在转录时,正义—反义RNAs双链(dsRNAs)上的两个RNA聚合酶Ⅱ发生聚集碰撞而引起的。在简单的真核生物中,例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae),在基因及其调控元件之间由于相互挤压碰撞而产生的转录干扰是不可避免的[34]。
DNA甲基化DNA甲基化发生在CpG岛,并且通过头甲基化酶(DNMTs),例如DNMT3A和DNMT3B来甲基化[38]。Dnmt1以半甲基化DNA为底物来维持DNA甲基化。肿瘤的表观遗传标志物在总体基因组DNA中低甲基化,而在肿瘤抑癌基因中超甲基化[39]。但是,起始和协助DNA甲基化的机制还很不清楚。Imamura等[40]报道鞘氨醇激酶1(Sphk1)的NAT过表达诱导CpG岛去甲基化,而在正义链3′非CpG位点重新甲基化。在遗传性地中海贫血中血红蛋白a2(HBA2)能指导CpG岛甲基化[41]。NAT介导的CG去甲基化和非CG甲基化提示这可能是表观遗传的一个新机制[10]。
组蛋白修饰组蛋白修饰包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、小泛素相关修饰和糖基化。不同修饰方式相结合导致基因活化或基因抑制[42-43]。组蛋白乙酰化和甲基化也许对DNA修复和基因转录有直接的影响。通常,组蛋白乙酰基转移酶(HACs)和组蛋白去乙酰基转移酶(HDACs)介导的组蛋白乙酰化是一个基因活化的标志[39,44]。组蛋白甲基化由组蛋白甲基化转移酶和去甲基化转移酶调节。组蛋白H3第4位赖氨酸(H3K4)的单、双和三甲基化与转录活化密切相关,然而组蛋白H3第9位赖氨酸(H3K9)的双和三甲基化与转录抑制密切相关[45]。而且,组蛋白H3第20位赖氨酸甲基化与转录也密切相关[46]。Xist基因与X染色体失活有着密切关系,在启动子区域,Xist基因反义转录物Tsix通过募集组蛋白修饰蛋白复合物可以使Xist失活[47]。在H3K4细胞中P15的反义转录物通过增加H3K9的二甲基化和减少H3K4二甲基化来下调P15。在启动子区,正义和反义转录物之间的双向结构的形成可能直接或间接的促进或抑制组蛋白–修饰蛋白复合物的结合。因此,NATs和组蛋白修饰之间的相互作用也为表观遗传学提供了新的机制。NATs和DNA甲基化,NATs和组蛋白修饰以及DNA甲基化与组蛋白修饰之间的密切关系均已被发现。在基因启动子区CpG岛的超甲基化引起了局部组蛋白的去乙酰化。H3K4的去甲基化与启动子甲基化相关,然而低乙酰化诱导了DNA甲基化[48]。因此,在基因调节过程中,不同种类的表观遗传修饰紧密联系而且协同作用。
NATs与疾病
NATs与肿瘤据报道在肿瘤中,大部分基因组发生了去甲基化,转录噪音增加可能引起反义转录物产生,反义转录物进而影响关键抑癌基因功能,最终导致肿瘤恶性转化。Orfanelli等[49]在黑素瘤TRPM2位点发现一种新型的正义TRPM2-TE和反义转录物TRPM2-AS。在黑素瘤中TRPM2-TE和TRPM2-AS表达上调,而且他们的活化与CpG岛甲基化状态有关。TRPM2-TE敲除和野生型TRPM2一样增加了黑素瘤对凋亡和坏死的易感性。缺氧诱导因子1(HIF-1)的一个反义转录物aHIF已经被证明在正常人组织中广泛表达[50],在肾癌中由于vhl基因突变引起aHIF永久性的过表达[28]。此外,在乳腺癌中aHIF过表达,且aHIF表达水平与肿瘤预后呈负相关[28,51]。在永生化的淋巴细胞系中低氧可以诱导aHIF产生[28],表明HIF-1的反义转录物aHIF与HIF-1a共同参与了代谢调控通路。Survivin是一个新型的凋亡抑制剂,在肿瘤细胞中表达,而在正常成熟组织中不表达,被认为是一种很有潜力的抗肿瘤治疗的靶点。在一种人来源的结肠癌细胞系中,诱导survivin的一个NATs效应细胞蛋白酶受体(EPR-1),导致survivin表达下调,同时引起细胞增殖减慢,凋亡增加,对抗肿瘤制剂敏感性也增加。此外,EPR-1可使皮下肿瘤尺寸显著减小,如果与抗肿瘤药物联合使用这种效应会增强。这些结果提示,通过诱导EPR-1cDNA来调节survivin也许是一种非常有潜力的治疗结肠癌的方法[52]。Ca-paccioli等[53]发现了一个bcl-2/IgH的反义转录物下调了人滤泡淋巴瘤细胞系t(14;18)DOHH2中bcl-2基因表达。
NATs与人类其它疾病与目前广泛应用的沉默基因或改造在mRNA剪接方式等方法相比,体内特异性基因的上调是基因治疗的可望而不可及的目标。Modarresi[54]及其同事成功上调脑源性神经营养因子(BDNF)表达。他们通过抑制BDNF的一个NAT来阻断寡核苷酸向小鼠中枢神经系统的运输,从而抑制了BDNF水平,这将是大量神经退行性疾病治疗的一个重要靶点,如果采用小分子或microRNA抑制剂,有可能导致不相干基因活化。亨丁顿舞蹈症(Huntington’sdisease,HD)是一种渐进性的神经退化疾病,是由亨丁顿(HTT)基因外显子的一个CAG重复扩增而引起。Chung等[55]鉴定出HTT反义RNA(HTTAS),即一个在HD重复序列位点的NAT,HTTAS从4个选择性位的起始转录,在HD大脑组织中发现2个HTTAS剪切异构体。几乎所有的人类遗传疾病均是由于个别几个相关基因或调控序列的突变而引起的。Tufarelli等[56]研究发现,在转基因模型小鼠以及分化的干细胞中,RNA反义转录物介导相关CpG岛的沉默和甲基化。这些发现提出了一个人类遗传性疾病发生的新机制。
总结与展望
综上所述,哺乳动物NATs的主要特点如下[24]:(1)NATs比以前假设的种类更多;(2)NATs代表一种基因调节现象;(3)NATs更普遍的是代表非编码RNA;(4)NATs以顺式(与相应正义转录物在相同位点)或反式(与相应正义转录物相隔一段距离)形式出现;(5)只有很少数NATs功能被注释;(6)有一些NAT参与生理或病理功能调节;(7)NAT可能是一类潜在的新兴药物靶点,可以使正义基因和/或转录物上调或下调。NATs是一类调节RNAs,在mRNA和/或蛋白水平上,对正义转录物起重要调节作用[8]。通过正义—反义双向结构的形成,NAT以正反馈或负反馈方式调节正义转录物。在正反馈调节中,通过上调肿瘤抑制基因NATs来再活化异常沉默的肿瘤抑制基因。相反,在正反馈调节中,过度表达的原癌基因可以被下调的NATs沉默。对不能耐受化疗药物毒性的患者来说,NATs可能是另一种新型的治疗方法。而且,在肿瘤组织中NATs的表达水平与正常组中不同。因此,NATs可以作为监测肿瘤发展的分子标志物。表观遗传的改变是可逆的,并且在疾病的发生和发展中逐渐引起了重视。表观遗传治疗也被认为是最有前景的治疗方法之一[57]。最近,两类抑制DNA甲基化或组蛋白乙酰化的表观遗传药物已经被研制,包括DNMT抑制剂(例如,5-氮杂胞苷和地西他滨),HDACs抑制剂(曲古菌素A,异羟肟酸),部分药物已经应用与临床[58-59]。但最近研究表明,一些患者不能耐受药物毒性。因此,探寻其他有前景的药物是必须的。调节RNAs在表观遗传过程中起重要作用,这为药物设计策略提供了新的未来。很多调节RNAs对蛋白编码基因敏感[60]。
自从最初直接将反义转录物作为新兴药物候选靶点迄今已20余年了,很多研究相继采用小分子、反义寡核苷酸、核酶或寡核苷酸适配子等,重点瞄准mRNAs。在欧洲一些反义药物已经进入临床试验阶段。福米韦生(Vitravene)是第一个被美国FDA批准的反义药物,用于艾滋病人视网膜炎的治疗[61]。G3139是Bcl-2的反义寡核苷酸,能从mRNA和蛋白水平上下调Bcl-2表达。G3139已经应用于人类疾病临床三期试验[62]。NATs是细胞中内源性的转录物,且广泛存在,不仅以有效的和特异的方式调节其相应关正义转录物而且副作用小,在体内几乎没有毒性。NATs可能是一种丰富的生物分子资源,可用于表观遗传学,在未来有潜在的诊断和治疗价值[60]。
作者：骞爱荣李迪杰商澎单位：西北工业大学生命学院,西北工业大学特殊环境生物物理学研究所空间生物实验模拟技术国防重点学科实验室