分离原料乳中假单胞菌的噬菌体

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1材料与方法

1.1.材料与仪器

来自当地食品工厂及医院排放的未经处理的污水；10株试验用假单胞菌均分离自当地奶户家的原料奶并由实验室保存；TSBYE培养基：胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，NaCl5g，磷酸氢二钾10g，葡萄糖10g，酵母粉10g，加蒸馏水至1000mL，用于假单胞菌液体以及固体培养；CM溶液：2.5g/LMgSO4•7H2O，0.05g/L明胶，1mol/L的Tris缓冲液6mL，0.735g/LCaCl2，pH7.5，用于噬菌体原种的保存。日立H-7650型透射式电镜；0.22μm×25mm微孔滤膜北京牛牛基因技术有限公司；GL-21M高速冷冻离心机上海市离心机械研究所；TGL16G台式高速离心机上海医用分析仪器厂；DELTA320精密pH计梅特勒-托利多仪器有限公司；SPX-150B生化培养箱上海佳胜实验设备有限公司。

1.2.实验方法

1.2.1.噬菌体的分离

1.2.1.1.噬菌体的初步分离将10mL消毒前污水、1mL处于对数期的宿主菌液、以及一定量的CaCl2溶液加入到100mL灭菌后的新鲜TSBYE液体培养基中，充分混匀并使混合体系的CaCl2终浓度约为10mmol/L。混合液在30℃，100r/min振荡培养24h后，于4℃下5500×g离心15min，取上清液并用微孔滤膜（孔径0.22μm）对上清液过滤除菌，所得过滤后上清液即为拟含有相应宿主菌噬菌体的原液，在4℃下保存备用。采用Sambrook等人的双层琼脂平板印迹法[12]进行噬菌体的初步分离。若发现疑似噬菌斑，则吸取得到含有疑似噬菌斑的琼脂块，并将此琼脂块加入到1mL的CM溶液中，室温下静置24h后，用0.22μm微孔滤膜过滤此混合液，所得清液即为可能含有相应宿主菌噬菌体的悬浮液。

1.2.1.2.噬菌斑的纯化及噬菌体原种的获得采用Sambrook等人的双层琼脂平板法[12]对可能含有相应宿主菌噬菌体的悬浮液进行验证，同时进行噬菌斑的纯化。将噬菌斑纯化3～5次直至得到形态一致的噬菌斑，纯化后的噬菌体悬浮液，即噬菌体原种，保存在4℃条件下。

1.2.2.噬菌体的电镜观察取20uL纯化后的高滴度噬菌体悬液（108~109PFU/mL）滴于覆有Formvar膜的铜网上，静置沉淀15min，之后以2%磷钨酸(PTA)(pH7.0)染色15s，用干燥滤纸从侧面吸去染液，自然干燥后用日立H-7650型透射式电镜观察。

1.2.3.噬菌体与宿主菌的交叉培养试验采用Sambrook等人的双层琼脂平板法[12]，将分离到的3株噬菌体与10株原料奶中分离得到的假单胞菌宿主菌进行交叉裂解，根据噬菌斑鉴定各噬菌体是否存在交叉宿主菌。判定标准：25℃过夜培养后出现中心清亮透明，边缘清晰的裂菌性噬菌斑记为“++”；出现边缘有模糊晕圈的半透明噬菌斑记为“+”；无噬菌斑记为“-”。

1.2.4.不同理化因素对噬菌体感染性的影响

1.2.4.1.温度对噬菌体活性的影响取100μL噬菌体扩增液（105PFU/mL）和100μL（108CFU/mL）宿主菌振荡混合并吸附10min，如此制备3份噬菌体与其宿主菌吸附后的混合液，将每份吸附后混合液分别加入3管装有10mL液体TSBYE培养基中，并加入CaCl2，使每管混合液中CaCl2终浓度为10mmol/L，分别静置培养于4、25、37℃，采用Sambrook等人[13]的双层琼脂平板法于24、48、72h测定噬菌体的滴度。

1.2.4.2.pH对噬菌体活性的影响取100μL噬菌体扩增液（105PFU/mL）和100μL（108CFU/mL）宿主菌振荡混合并吸附10min，如此制备6份噬菌体与其宿主菌吸附后的混合液，将每份吸附后混合液分别加入6管装有10mL具有不同pH的液体TSBYE培养基中（pH分别为4、5、6、7、8、9），并加入CaCl2，使每管混合液中CaCl2终浓度为10mmol/L，静置于25℃培养，采用Sambrook等人[13]的双层琼脂平板法于24、48、72h测定噬菌体的滴度。1.2.4.3.NaCl浓度对噬菌体活性的影响取100μL噬菌体扩增液（105PFU/mL）和100μL（108CFU/mL）宿主菌振荡混合并吸附10min，如此制备5份噬菌体与其宿主菌吸附后的混合液，将每份吸附后混合液分别加入5管装有10mL具有不同NaCl浓度的液体TSBYE培养基中，并加入CaCl2，使每管混合液中CaCl2终浓度为10mmol/L，静置于25℃培养，采用Sambrook等人[13]的双层琼脂平板法于24、48、72h测定噬菌体的滴度。通过预试验发现，当培养基中NaCl浓度大于9.5%时，分离所得噬菌体不生长，所以试验中将培养基内的NaCl浓度分别调为1.5%、3.5%、5.5%、7.5%、9.5%。

2结果与分析

2.1噬菌体的分离纯化以10株假单胞菌为宿主，分离出3株噬菌体，即PP6、PP8和PP10。发现这3株噬菌体分别侵染假单胞菌P6、P8和P10，并出现了圆形透明噬菌斑（图1），中心清亮透明，边缘清晰，纯化后的噬菌体悬液增殖后滴度可达到108PFU/mL以上。

2.2噬菌体的电镜观察采用透射电镜观察分离得到的3株噬菌体的形态特征和结构，结果见表1以及图2、3、4，结合国际病毒分类学委员会（InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses，简称ICTV）第8次报告的最新病毒分类系统的标准[13]，可推测噬菌体PP6、PP8、PP10为轻小(光滑)噬菌体科。

2.3噬菌体与各个宿主菌的交叉培养试验噬菌体与各宿主的交叉裂解试验见表2，由表2可知，3株噬菌体均存在交叉宿主菌，即每株噬菌体除对自身宿主菌具有裂解作用外，对其余9株从原料奶中分离出的假单胞菌（Pseudomonasspp.）也都具有裂解作用。

2.4部分理化因素对噬菌体活性的影响

2.4.1不同温度对噬菌体活性的影响分别在4、25、37℃下静置培养72h的噬菌体PP6、PP8和PP10的滴度如图5所示。总体上看，在不同温度条件下，噬菌体PP8的滴度相对较高，最高滴度可分别达到5.25×106PFU/mL（4℃生长48h）；而噬菌体PP6和PP10的滴度则维持在较低水平，最高滴度只分别达到1.18×106PFU/mL和3.75×105PFU/mL；而且随温度升高，噬菌体PP8和PP10的滴度呈递减趋势，而噬菌体PP6的滴度则呈递增趋势。对3株噬菌体逐一分析发现，在4℃条件下噬菌体PP8和PP10的滴度分别处于其最高水平，且在此条件下，随培养时间的延长，噬菌体PP10的滴度逐渐升高，而噬菌体PP8的滴度则呈现先升高后下降的趋势，于48h滴度达到最高，为5.25×106PFU/mL，约为24h及72h时滴度的2倍。噬菌体PP6的滴度则在37℃条件下处于其最高水平，且在此条件下，滴度随培养时间延长呈递减趋势，24h时滴度达1.18×106PFU/mL，为最高，至72h滴度下降了近2个数量级。

2.4.2不同pH对噬菌体活性的影响总体上看，在不同pH条件下，噬菌体PP8的滴度相对较高，最高滴度可达到6.05×106PFU/mL（pH为6的条件下生长24h）；而噬菌体PP6和PP10的滴度则维持在较低水平，最高滴度只分别达到1.32×106PFU/mL和2.10×106PFU/mL；而且随pH的升高，3株噬菌体的滴度均呈现先升高后降低的趋势。pH5～7范围内，3株噬菌体的滴度处于较高水平。此外，72h内噬菌体PP8和PP10在pH为4～9的范围内均能生长，噬菌体PP6只能在pH为4～8的范围内生长，在pH为9时未检测到噬菌体PP6的滴度。噬菌体PP6和PP8在pH为6时得到其最高滴度，在此pH下，培养24h时噬菌体PP8的滴度达最高，6.05×106PFU/mL，此后随培养时间延长而逐渐降低，至72h时滴度下降了近2个数量级；噬菌体PP6在此pH下也于培养24h时达到其最大滴度，为1.32×106PFU/mL，培养48h时滴度降至3.7×104PFU/mL，但培养72h后滴度又回升至8.7×105PFU/mL。噬菌体PP10则在pH为7时，滴度最高，培养48h时滴度达到最高，为2.10×106PFU/mL，至72h时滴度下降2个数量级。

2.4.3不同NaCl浓度对噬菌体活性的影响3株噬菌体分别在不同NaCl浓度条件下静置培养72h的生长如图7所示。在NaCl浓度为1.5%～9.5%的范围内，噬菌体PP8和PP10的滴度相对较高，最高滴度可分别达到3.75×106PFU/mL（3.5%NaCl的培养基中生长48h）和4.00×106PFU/mL（1.5%NaCl的培养基中生长24h）；而噬菌体PP6的滴度则相对较低，最高滴度仅为1.25×106PFU/mL（3.5%NaCl的培养基中生长24h）。在试验的72h内，3株噬菌体在含1.5%、3.5%、5.5%NaCl的培养基中生长相对较好，当培养基中NaCl达到7.5%时，3株噬菌体的活性显著下降，当培养基中NaCl达到9.5%时，3株噬菌体的滴度一直未被检测到。此外，在不同NaCl浓度下，随时间的延长，3株噬菌体的生长不具有显著的规律性。

3讨论

一般噬菌体分为毒性噬菌体(即裂菌性噬菌体)和温和噬菌体(即溶原性噬菌体)。毒性噬菌体在固体培养基上形成清晰、透亮的溶菌空斑，即透明噬斑；而温和噬菌体在固体培养基上形成浑浊的半透明噬斑[14]。本试验分离出的3株噬菌体形成的噬菌斑均表现为毒性噬菌体的噬斑特征，故此3株噬菌体均为毒性噬菌体。根据以往的报道，已分离得到的假单胞菌属的噬菌体在电镜下的形态各异，主要有短尾噬菌体(Pedoviridae)、肌尾噬菌体(Myoviridae)、长尾噬菌体(Styloviridae)和轻小(光滑)噬菌体(Leviviridae)。如SannaSillankorva等[15]分离的荧光假单胞菌噬菌体IBB-PF7A、张克斌[16]分离的铜绿假单胞菌噬菌体PaP2和PaP3属短尾噬菌体科；张克斌[16]分离的铜绿假单胞菌噬菌体PaP1属肌尾噬菌体科；王子微[14]分离的荧光假单胞菌噬菌体KS461-2属于长尾噬菌体科；已经公布于NCBI的假单胞菌属噬菌体PP7则属于轻小(光滑)噬菌体科[17]。本试验中根据3株噬菌体在电镜下的形态，可以初步推断噬菌体PP6、PP8和PP10属为光滑噬菌体科，但要对这3株噬菌体进行准确的分类，还需要分析噬菌体的基因组，并确定其核酸类型。要将分离到的噬菌体应用于食品中，就必须了解不同理化条件对噬菌体生理特性的影响。一般来说，在食品及食品原料的加工、运输或保藏中最易发生变化的三种理化条件是温度、pH和渗透压，而且食品加工、运输或保藏中最常见的温度为4℃、25℃和37℃，多数食品pH范围一般在4～9，NaCl浓度在1%～10%，所以本试验研究了这三种理化因素对噬菌体活性的影响。在国内，研究不同理化条件对噬菌体活性的影响时，一般采用的方法是将噬菌体置于不同温度或不同pH条件下1h，每隔5～20min测定一次噬菌体的滴度，并绘制出噬菌体在不同条件下于1h内滴度的变化曲线，从而对噬菌体在不同条件下活性的变化作出评价[18-20]。这种试验设计虽然能在短时间内获得噬菌体活性变化的信息，但在实际生产中，食品在运输或保藏中经历的时间超过1h，如原料奶从挤出、运输、贮藏到加工之前，中间甚至要经历24h，所以将噬菌体置于不同理化条件下作用更长的时间，并了解其间噬菌体活性的变化趋势，对于实际生产意义更为重大。综上，本试验参照TarekEl-Arabi[21]对蜡样芽孢杆菌噬菌体生理特性进行研究的方法进行试验。不难看出，噬菌体PP8和PP10在4℃下能保持较高的活性，因此，它们在低温贮藏的食品原料中具有较大的应用潜力，可能会与低温形成协同增效的作用。而噬菌体PP6则更适合应用在不得不处于相对高温环境下的食品中。3株噬菌体在pH为5～7以及NaCl为1.5%～5.5%的范围内保持较高活力，在pH为4或9以及NaCl为7.5%～9.5%这样过酸过碱或渗透压较高的条件下，活性受到抑制，这是由于在这样相对极端的条件下，宿主菌的代谢活力受到了抑制[22]，高渗透压条件会阻止核衣壳的合成和噬菌体核酸的注入[23-25]，同时高渗透压条件也造成噬菌体凝聚成束，从而减少了和宿主菌相吸附的位点[24]。

4结论

综上所述，本试验以10株原料乳中假单胞菌为宿主，分离得到3株裂菌性噬菌体，初步推断噬菌体PP6、PP8和PP10为轻小(光滑)噬菌体；噬菌体PP8和PP10在4℃下能保持较高的活性，而噬菌体PP6则在37℃条件下活性较高；3株噬菌体在pH为5～7以及NaCl为1.5%～5.5%的范围内保持较高活力。3株噬菌体在原料乳或食品中假单胞菌的控制方面，均具有较大的应用潜力。

作者：胡子毅孟祥晨杨丽梅杨杰刘欢单位：东北农业大学乳品科学教育部重点实验室东北农业大学食品学院