短肽模拟脂多糖研究论文
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摘要目的：得到拟类脂A的六肽。方法：用抗类脂A的单克隆抗体筛选噬菌体随机六肽库，经四轮筛选后进行ELISA检测,用得到的15个阳性克隆分别免疫小鼠，并将使小鼠产生抗LPS抗体的10个克隆进行测序，将保守序列进行肽合成。结果：得到保守序列为Lys-Phe-Ser-Ser-Arg,即KFSSRX。固相合成此小肽可与其1B6抗体结合，且此结合可被LPS抑制。结论：此六肽可模拟脂多糖或类脂A表位。
关键词脂多糖模拟短肽噬菌体肽库
PreparationofpeptidesmimicringlipidAepitopeusingphagedisplaypeptidelibrary
BAOYong-Li,FUNing①,YANGGui-Zhenetal.
DepartmentofImmunology,NormanBethuneUniversityofMedicalSciences,Changchun130021.①DepartmentofImmunology,FirstMilitaryMedicalUniversity，Guangzhou510515
AbstractObjective:FindingmimicLipidA6-merpeptides.Methods:Usedanti-LipidAMcAbtofishoutphagedisplay6-merpeptiderandomlibrary.After4roundsselection,15positiveclonesweredetectedbyELISAandusedtoimmunizemice.TenofthemcouldgetantibodyforLPS.ToanalyzetheDNAsequencesandtosynthesizethepeptidefromconservativesequences.Results:TheconservativeaminoacidsequenceisLys-Phe-Ser-Ser-ArgorKFSSRX.Thesolidphasesynthesispeptidecanbindto1B6antibodyandthisbindingcanbeinhibitedbyLPS.Conclusion:Theseresultssuggestthat6-merpeptidecanmimicrytheepitopeofLPSorLipidA.
KeywordsLPSMimicpeptidePhagedisplaypeptidelibrary
已知细菌脂多糖为非胸腺依赖抗原，难以诱导有效的免疫回忆反应，90年代初曾有人用抗独特型抗体成功地模拟了脂多糖表位，提示了用蛋白或多肽模拟脂多糖的可能性。从噬菌体肽库中筛选目的短肽是近年来发展起来的一项新技术，是研究蛋白质分子之间相互作用的一个有效工具。本研究用具有交叉反应性的抗鼠伤寒杆菌脂多糖类脂A单克隆抗体筛选噬菌体随机六肽库，旨在得到可模拟脂多糖类脂A表位的短肽，为研制具有胸腺依赖性抗原性质的LPS疫苗及内毒素拮抗剂奠定基础。
1材料与方法
1.1材料噬菌体随机六肽库及大肠杆菌K91Kan均为美国密苏里大学Smith博士惠赠；T7DNA聚合酶测序试剂盒购自Promega公司；32P-dATP购自北京亚辉公司；抗类脂A单抗1B6为IgG1亚类系本室自制，方法见文献［1］；豚鼠抗野生型M13噬菌体抗体为本室制备。
1.2噬菌体六肽库的筛选亲合素包被全塑培养皿，4℃过夜，1%BSA封闭，4℃1h，加入生物素化单克隆抗体1B6室温2h，加肽库，4℃作用1h洗去未结合的噬菌体，用洗脱液解离已结合的噬菌体，侵染K91Kan，扩增并提取噬菌体，用于下一轮筛选。共进行4轮筛选，每一轮都不断减少生物素化单抗的用量及单抗与肽库作用时间旨在得到高亲和力，特异性强的克隆。四轮筛选后挑选单斑扩增，PEG沉淀回收噬菌体，并测其滴度，详见文献［2］。
1.3夹心ELISA法筛选阳性噬菌体克隆用1B6包被酶标板，1％BSA封闭后加筛选出的噬菌体克隆，同时以野生型噬菌体Fuse1为对照，43℃30min后加豚鼠抗M13血清，43℃30min后加HRP-SPA，最后加OPD显色，酶标仪测OD490值。
1.4阳性噬菌体克隆免疫原性的测定用筛选出的15个阳性克隆及野生型噬菌体分别免疫Swiss小鼠，每次1012个颗粒，第1次加弗氏佐剂免疫，14d后用噬菌体颗粒直接腹腔注射，2次免疫后5d取血清，间接ELISA方法测LPS抗体。用LPS包被，加入待测血清，然后加入兔抗鼠丙种球蛋白，再加入HRP标记的驴抗兔IgG，最后加OPD显色，测OD490值。
1.5阳性噬菌体克隆DNA序列分析用Sanger双脱氧末端终止法对可刺激小鼠产生抗LPS抗体的噬菌体克隆进行序列分析，测引物序列为5′HO-TGAATTTTCTGTATGAGG-OH3′，测序方法参照Promega公司T7DNA聚合酶测序试剂盒说明书。
1.6模拟短肽的固相合成根据阳性克隆的保守序列在TentaGelS树脂珠上合成固相短肽。方法为固相Fmoc化学合成法，如下：合成反应在8.0×1.6cm的Polypropylene柱中进行，将3倍克分子浓度的L型Fmoc氨基酸及交联剂BObT及DIC加入溶涨的TentaGelS树脂珠，交联时间为1h，反应过程均用Ninhydrintest检查其完全程度。Fmoc氨基酸脱保护剂为20％Piperidine/DMF。全部交联完成后用三氟乙酸(TFA)/Phenol/Ethaneditiol/Anisole(94:2:2:2V/W/V/V)去侧链保护基，用DMF，甲醇，双蒸水及PBS洗涤并保存于含0.02％NaN3的PBS备用。
1.7合成短肽的抗原性鉴定以0.2μg/ml生物素标记1B6抗体与短肽交联树脂珠混合，室温振摇2h，洗涤后加入碱性磷酸酶标记的亲和素，室温1h，洗涤后加入底物BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indoyl-phophate)溶液，立即倒入3.5cm平皿，呈色反应完全后以1mol/LHCl终止反应。阳性树脂珠于普通光学显微镜下呈绿色。抗原竞争试验即于加抗体同时加入150μg/ml的LPS，余同上。
2结果
2.1阳性克隆的筛选及免疫原性的测定从第4轮筛选洗脱物中任选22个克隆以双抗体夹心ELISA测定其抗原性，用PBS调零点，Fuse1为对照。结果如表1所示。
经ELISA法筛选后得到15个阳性噬菌体克隆，将其分别免疫Swiss小鼠，结果2次免疫后有10个克隆产生抗LPS抗体，其中有2个克隆效价较高，结果见图1。
表1用夹心ELISA法检测噬菌体克隆抗原性
Tab.1AntigenicitydetectionofphageclonesbysandwichELISA
No.ofphagecloneOD490nmNo.ofphagecloneOD490nm
10.53120.92
20.37130.62
30.23140.83
40.43150.67
50.45160.21
61.07170.37
70.36180.85
81.05190.94
91.02200.80
100.52211.01
110.84220.70
Control（Fuse1）0.20
图1阳性克隆免疫小鼠血清LPS抗体效价的测定
Fig.1Titerofmurineanti-LPSantiserumimmunizedwithpositivephageclone
表2拟类脂A合成肽的抗原性
Tab.2TheantigenicityofsynthesismimiclipidApeptides
No.andsequencesofpeptidesBiotin-1B6Biotin-1B6mixedwithLPS
1.KFSSRF+++++
2.Ac-KFSSRF++++
3.AFSSRA++++
4.Ac-AFSSRA－N
5.KCSSRK+N
6.Ac-KCSSRK－N
7.YGGFL－N
8.Ac-KPfQwFwLQ－N
9.rPKPwQwFwLL－N
Note：SmalllettershowDtypeaminoacid；N:Notdone
2.2拟类脂A六肽编码DNA序列分析将10个可使小鼠产生抗LPS抗体的噬菌体克隆通过Sanger末端终止法进行测序，结果其序列为5′-AAGTTTAGTTCTCGTTTC（部分为TTG)-3′进而推断其氨基酸序列为Lys-Phe-Ser-Ser-Arg-Phe（或Leu)即KFSSRX。其N末端5个氨基酸序列呈高度保守。
2.3合成短肽的抗原性鉴定根据上述保守序列合成的六肽交联树脂珠可与生物素标记1B6单抗反应，且可被LPS特异性抑制，见表2中的短肽1～3。这一结果说明KFSSRF可模拟特异性LPS类脂A表位，N末端乙酰化对其与抗体的结合有轻度影响；用甘氨酸置换两端的短肽3仍具有较好的抗原性，但乙酰化的短肽则不能与抗体结合。对照短肽5.6为用无关抗体筛出的与短肽1～4有共同序列SSR的短肽，其不能被1B6抗体结合说明FSSR为该目的短肽所必需的核心序列；对照短肽7、8、9分别为内啡肽及P物质（SubstanceP)表位合成模拟短肽［3，4］。
3讨论
随着分子生物学技术的迅速发展，大量的蛋白质分子得以被克隆、重组、改造，表达并付诸应用，存在于许多细菌，病毒，真菌及肿瘤细胞表面多糖抗原表位的重要性也日渐被重视。曾认为分子生物学及蛋白质化学技术无法直接用于研究多糖，而噬菌体肽库与合成肽库技术的出现为研究并以短肽模拟多糖表位提供了有效的工具。已有实验证实用抗多糖抗体或酶的底物从肽库中筛出的短肽不但具有多糖表位的抗原性，而且可模拟多糖的功能。如Kooyman等从噬菌体肽库中筛出并合成的六肽分子可模拟大量存在于猪红细胞表面的Galα1.3(galactosyl)，并抑制热灭活的人血清对猪红细胞的凝集作用［5］，这正是异种移植中亟待解决的难题之一。Taki等尝试从噬菌体肽库中筛选出(神经)糖鞘脂的模拟肽，根据其编码核苷酸合成的九肽不但模拟了糖脂的抗原性，而且引人注目的是可调节糖苷酶的活性［6］。对病原微生物多糖的模拟短肽研究目前主要限于新型隐球菌多糖,链球菌荚膜多糖及HIV多糖［7-9］。有关革兰氏阴性菌脂多糖内毒素方面仅Phalipon等进行了LPS的O抗原的模拟肽研究［10］，尚未见到有模拟LPS类脂A表位的报道。
脂多糖内毒素(LPS)是革兰氏阴性菌的共同致病成分，目前虽可应用大量的抗生素治疗该类细菌的感染，但菌体死亡后释放的脂多糖（LPS）仍可造成机体的严重损伤。类脂A为LPS毒力中心，且在各种革兰氏阴性菌中高度保守，LPS对机体的损伤主要是通过此部位与血浆中的LPS结合蛋白（LBP）结合，再与巨噬细胞及淋巴细胞上的CD14分子结合，从而使巨噬细胞等释放一系列的细胞因子IL-1，TNF等造成机体的损伤［11］。目前有人采用针对LPS，IL-1及TNF的抗体治疗革兰氏阴性菌败血症，但效果均不显著，且有不同程度的副作用［12］，亦有人尝试用类脂A的结构类似物作为拮抗剂［13］。由于LPS及类脂A均为胸腺非依赖性抗原不能诱导有效的再次应答，也难以成为有效的疫苗用于预防。本研究用具有交叉反应性的抗鼠伤寒杆菌类脂A保护性单抗筛选噬菌体随机六肽库，所得的阳性克隆其编码序列呈高度保守，为KFSSR。据此序列合成的短肽在体外反应显示了较好的抗原特异性。因条件所限暂未进行各位置上的氨基酸置换，但以FSSR为核心将两端换为甘氨酸仍具有良好的抗原性及对照短肽5仅具有微弱抗原性可提示FSSR为该表位的核心序列。N末端乙酰化的目的是延长其体内半衰期，但本实验结果提示乙酰化对抗原性有不同程度的影响，这是在设计体内实验时应予以考虑的。在进行免疫原性测定时，各个克隆刺激小鼠产生的抗体效价高低不一，但测序结果显示为同一序列，其原因可能是普通小鼠个体差异较大所致，其次与免疫次数较少亦有关。
本研究证实了表达于噬菌体表面的短肽可模拟脂多糖类脂A表位，且据此合成的六肽即可具有较好的抗原性。此结果将为进一步研制拟LPS表位的多肽疫苗及内毒素的新型拮抗剂奠定基础。
致谢：本研究的肽合成部分工作是在美国ArizonaCancerCenter的LamKS的指导下完成的,在此表示感谢。
噬菌体表达短肽模拟脂多糖类脂A表位的研究本项目受国家自然科学基金资助(No.39470658)
富宁现在第一军医大学基础医学院免疫教研室，广州510515
作者简介：鲍永利，女，30岁，讲师，从事免疫生物工程方面的研究；
富宁，女，45岁，教授，主要从事抗感染免疫及细胞因子受体的研究
作者单位：（白求恩医科大学基础免疫学教研室，长春130021)
4参考文献
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