抑制IL―17活性短肽疫苗的抗动脉粥样硬化的治疗作用

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摘要：目的 将具有抑制il-17活性的短肽疫苗主动免疫ApoE-/-小鼠，研究IL-17疫苗对动脉粥样硬化的治疗作用。方法 选取8 w龄健康雄性ApoE-/-小鼠，分两组，一组用生理盐水腹腔注射，一组用IL-17疫苗（0002）腹腔注射，每组12只，分别于0、2、4、6 w共免疫4次，实验结束后，测体重，以自动分析仪检测血清中血脂含量，留取心脏以油红染色的方法检测主动脉瓣环及主动脉大体标本的斑块面积及其成分分析。结果 结果表明IL-17疫苗（0002）在未影响小鼠体重及血脂情况下显著的减少斑块面积（P

关键词：抑制IL-17活性短肽疫苗；ApoE-/-小鼠；动脉粥样硬化；斑块面积

动脉粥样硬化（AS）及其心血管并发症严重威胁人类健康。现代研究证实，动脉粥样硬化是一种缓慢进展性自身免疫性血管疾病。T淋巴细胞是介导特异性免疫应答的主要免疫细胞[1]，按照其功能不同可以分为多种亚群，如Th1、Th2、CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）等。以往的研究证实，AS动物模型和冠心病患者体内存在Th1细胞功能亢进和Treg细胞功能减低，抑制Th1细胞功能可以延缓AS进程[2-3]。

最近研究发现，机体存在一种新型的不同于Th1和Th2的CD4+效应性T细胞，该细胞特异性的产生白介素17（IL-17），称为Th17细胞。有研究表明，冠心病患者和AS小鼠体内存在Th17细胞功能亢进，应用抗IL-17抗体干预可以显著减少AS斑块面积，提示IL-17在AS发病中起到重要促进作用。因此，有理由针对IL-17这一靶点，进行免疫学干预，为AS的防治提供新思路。我们的前期实验筛选设计了4条IL-17肽段（0001、0002、0003、0004），通过实验证明了所制备的IL-17疫苗（0002）所产生的抗体具有高度的特异性、稳定性及中和活性，并发现此短肽疫苗能有效引起小鼠的免疫反应。为了研究IL-17疫苗对动脉粥样硬化的治疗作用，我们将筛选出短肽免疫ApoE-/-小鼠，进行该疫苗对动脉粥样硬化的有效性以及安全性实验。

1资料与方法

1.1 实验动物 SPF级近交系C57BL/6J背景ApoE-/-小鼠，购自Jackson试验室（Bar Harbor， Maine， 美国），由北京大学实验动物中心繁殖。

1.2主要试剂 冰冻切片及油红O染色：①O.C.T包埋剂；②4%多聚甲醛：多聚甲醛粉（sigma） 4 g，PBS 100 mL，水浴加热搅拌助溶，调节pH至7.2～7.6，4℃避光保存备用；③油红O储备液：油红O（sigma）0.5 g，异丙醇100 mL，倒入烧瓶内，水浴中加热溶解，静置冷却后过滤，4℃避光保存；④油红O工作液：油红O储备液 3份，蒸馏水 2份，混合后静置10 min，过滤后避光保存。

1.3动物模型及基本情况 本实验遵循实验动物伦理委员会的相关规定，并得到华中科技大学同济医学院实验动物研究委员会审核及认可。8 w龄雄性ApoE-/-24只，SPF环境中普食饮食喂养，分两组，一组用生理盐水腹腔注射，一组用IL-17疫苗（0002）腹腔注射，注射剂量见表1，分别于0、2、4、6 w共免疫4次，测体重，8 w后心室采血处死，血清50 uL每份分装保存于-20℃冰箱。以自动分析仪检测血清中血脂含量，包括：总胆固醇（TC），甘油三酯（TG）及高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C），见表1。

1.4油红染色及动脉粥样硬化斑块面积计算 小鼠采血处死后，快速分离其心脏及相连的部分升主动脉，小心剃除包裹的脂肪及结缔组织，PBS冲洗干净后，滤纸吸干，4%多聚甲醛中固定12～24 h，滤纸吸干，刀片齐左右心耳下缘平面横断，弃心尖部心脏，以心底面朝上主动脉部朝下的方向O.C.T包埋于铁托上，置于冰冻切片机速冻10 min左右待包埋剂冻硬，开始对主动脉根部进行连续切片，切片厚10 um，从主动脉瓣环出现开始计数至瓣环消失，每200 um处取一切片用于油红O染色。染色后的切片在带摄像头显微镜下拍照，单人盲法，用IMAGEPRO PLUS software（IPP）计算每片切片斑块面积，再计算每只小鼠所有切片的平均面积。油红O染色步骤如下：①冰冻切片于新鲜配制的60%异丙醇中漂洗20～30 s；②新鲜配制油红O工作液中染色时间15～30 min；③于60%异丙醇漂洗，去多余油红；④蒸馏水稍洗；⑤苏木素中复染10～15 s；⑥1%新鲜配制氨水中返蓝5～10 s；⑦自来水冲洗3～5 min；⑧于显微镜下拍照。

1.5统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件，数值变量以均数±标准差（x±s）表示。两组间比较采用t检验，P

3结果

3.1体重及血脂 在8 w的普食喂养过程中，小鼠均生长良好。与对照相比，腹腔注射IL-17疫苗（0002）并没有对ApoE-/-小鼠的体重及血脂造成影响，见表2。

3.2 IL-17疫苗减少斑块面积 本次实验中，8 w龄雄性普食喂养8 w，分别于0、2、4、6 w对IL-17疫苗（0002）与对照组共免疫4次，处死小鼠对两组ApoE-/-小鼠主动脉根部冰冻切片并行油红O染色并分析斑块面积，结果表明，IL-17疫苗（0002）治疗组斑块面积明显较对照组小（0.13±0.04 vs 0.25±0.05 mm2，P

IL-17疫苗（0002） 对照组

图1

图2 主动脉根部斑块面积统计图

3讨论

有研究表明以IL-17抗体处理的动脉粥样硬化自发小鼠，与对照组相比病理改变程度有所减轻，而临床上也证实了IL-17抗体能改善同为Th17细胞为主导作用的银屑病的早期临床症状。基于以上理论和实践基础，我们认为基于IL-17活性位点设计的IL-17疫苗，能通过在体诱导IL-17中和性抗体的产生而达到阻断动脉粥样硬化进展的作用。 我们通过IL-17疫苗（0002）主动免疫ApoE-/-小鼠而抑制其体内IL-17 功能，结果表明IL-17疫苗（0002）在未影响小鼠体重及血脂情况下显著的减少斑块面积（P

参考文献：

[1]Hansson GK.Inflammation，atherosclerosis，and coronary artery disease[J].N Engl J Med，2005，352：1685-1695.

[2]Daugherty A，Rateri DL.T lymphocytes in atherosclerosis：the yin-yang of Th1 and Th2 influence on lesion formation[J].Circ Res，2002，90（10）：1039-1040.

[3]Laurat E，Poirier B，Tupin E，et al.In vivo downregulation of T helper cell 1 immune responses reduces atherogenesis in apolipoprotein E-knockout mice[J].Circulation，2001，104：197-202.