枇杷花药培养愈伤组织诱导研究
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摘要 以枇耙花药为试验材料，采用完全组合设计研究了温度、蔗糖浓度、激素对花药愈饬组织诱导的影响。结果表明：预处理对花药愈伤组织诱导起决定作用，其中低温预处理对于花药愈伤组织诱导效果最为显著；MS培养基中加入0.5%～1.0%的2，4-D，5%～7%的蔗糖对枇杷花药诱导率最高。
中图分类号 S667 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）10-0064-01
枇杷（Eriobotrya japonica）为蔷薇科枇杷属，为亚热带常绿果树，果实肉质细软，风味独特，营养丰富，深受消费者喜爱，具有极高的营养价值、经济价值和药用价值，是我国南方特有的珍稀水果。但大多数枇杷品种种子大而多，一般可食率仅67%～74%，可食部分相对较少，影响了枇杷的食用价值与商品价值。选育少核、小核和无核枇杷品种成为枇杷育种工作的重要目标，而研究枇杷花药愈伤组织诱导，能为诱导单倍体植株奠定技术基础[1-2]。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料为宜宾职业技术学院农业科技园大五星、早钟6号及龙泉1号枇杷栽培品种的花药。从幼树及壮年枇杷植株上取不同直径为0.3～0.8 mm枇杷花蕾，在自来水中冲洗20 min，采用低温、热激、高渗透压与高速离心的方法，对花蕾进行预处理。
1.2 去绒灭菌
用手术刀片将经过预处理的枇杷花蕾表面绒毛刮去，用70%酒精浸泡30 s，后用0.5% HgCl2水溶液表面消毒8 min，再用无菌水冲洗4～5次，在无菌条件下拨开花蕾取出花药，同时彻底去除花丝。
1.3 预处理
低温4 ℃分别处理24、48、96、144 h，培养基中附加2.0 mg/L 6-BA和0.5 mg/L 2，4-D，添加7%蔗糖和0.6%琼脂。
1.4 培养基
采用MS大量元素、微量元素和有机物。培养基附加2.0 mg/L 6-BA和0.5 mg/L 2，4-D，并附加不同浓度的蔗糖（0、3%、5%、7%、9%）、葡萄糖（0、3%、7%、9%），0.6%琼脂。不同植物激素水平和浓度（2，4-D：0.01、0.02、0.05、0.10、0.30、0.50 mg/L）进行完全组合，添加7%蔗糖和0.6%琼脂。
1.5 试验过程
每个三角瓶接种20枚枇杷花药，用无菌封口膜密封，在25 ℃下黑暗条件下培养。培养1周后，将未污染的花药转入新鲜遇上组织诱导培养基上，每个三角瓶转入20枚枇杷花药。培养4周以后统计培养效果。
2 结果与分析
2.1 灭菌方式对愈伤组织形成的影响
将花药剥出以后，对花药进行灭菌处理受到的伤害较为严重，在接种后会快速褐变。对整个花蕾进行灭菌，使花药受到的灭菌剂的伤害降低。采用流水下冲洗花蕾1～2 h处理花蕾，然后用75%酒精处理30 s，0.1%升汞灭菌25～30 min，无菌水冲洗5～6次后，剥出花药，接种污染率高达90%。将枇杷花蕾表面绒毛刮去，然后再进行处理，会使污染率明显下降5%左右。
2.2 预处理对花药愈伤组织诱导的影响
没有经过预处理的枇杷花药在培养，对培养的反应差，诱导启动率诱导率低，基本产生不了愈伤组织。经过预处理后，诱导率明显提高。其中低温预处理对花药愈伤组织诱导效果最显著，对大五星枇杷诱导率达53%，龙泉1号达 56.33%，早钟6号74%。低温预处理从24 h增加到48 h，能显著提高诱导率，但再延长，愈伤组织诱导率则会逐步下降。
2.3 糖源种类和浓度对花药愈伤组织诱导的影响
蔗糖浓度从0增加到5%时，愈伤组织的诱导率也随之增加，其中早钟6号枇杷的花药愈伤组织诱导率最高。蔗糖浓度从7%到9%时，愈伤组织诱导率出现下降趋势。
2.4 激素种类、浓度和组合对花药愈伤组织诱导的影响
在MS培养基上，或者在MS培养基中添加IBA、NAA、IAA、6-BA的不同浓度和组合，均不能诱导出愈伤组织。但添加了2，4-D后，能诱导枇杷花药分化形成愈伤组织。并且2，4-D浓度从0.01 mg/L增加到0.50 mg/L时，诱导率也从2.33%增加到69.33%。但在0.5～1.0之间，处于不变状态。
3 结论与讨论
植物花药愈伤组织形成受多种因素的制约。该试验中，枇杷花蕾表面的绒毛给消毒造成了较大的困难，刮去绒毛后消毒灭菌能有效防止污染的发生。同时，预处理对花药愈伤组织诱导起决定作用，没有经过预处理的枇杷花药几乎不能诱导脱分化及再分化。花蕾经过预处理后，诱导率显著提高，在所有预处理方法中，低温预处理效果最为显著[3-4]。
糖类种类和浓度对花药愈伤组织的诱导率、愈伤组织发生时间、质地、组织学起源有显著影响。激素种类和糖类浓度均显著地影响到了愈伤组织的诱导率，2，4-D在枇杷花药培养中起着关键作用。但是，预处理对促进花药愈伤组织诱导的机制，以及愈伤组织再分化条件，需要进一步完善。
4 参考文献
[1] 张恢志.中国果树志：枇杷[M].武汉：华中农业大学出版社，1990.
[2] 张日清，闻丽，刘友垒，等.低温预处理对油茶花药愈伤组织诱导的影响[J].中南林学院学报，2005，25（6）：24-28.
[3] 陈红，王永清.枇杷花药培养诱导愈伤组织的研究[J].安徽农业科学.2007，35（27）：8453-8454.
[4] 陶炼，潘翠萍，谢红江，等.三倍体枇杷茎尖培养与植株再生[J].热带作物学报，2014，35（11）：2249-2254.