应用DNA微阵列技术研究三氧化二砷对RPMI 8226细胞的作用
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作者：王梦昌，刘陕西，刘蓬勃
【关键词】 三氧化二砷
［摘要］ 目的：应用cdna芯片技术研究三氧化二砷对多发性骨髓瘤细胞株RPMI 8226的作用。方法：采用包含4 096个人类基因的cDNA表达谱芯片，检测三氧化二砷作用于RPMI 8226细胞24 h前后其基因表达的变化。结果：在mRNA水平上，273个基因的表达发生了明显改变，其中121个基因表达上调，152个基因表达下调。结论：三氧化二砷可引起RPMI 8226细胞株一系列基因表达的改变。ZFYVE16、TXNIP及ALK1基因可能与RPMI 8226细胞的分化与凋亡密切相关。
［关键词］ 三氧化二砷; DNA微阵列; 多发性骨髓瘤
Changes of gene expression profile of multiple myeloma cell line RPMI 8226 treated by arsenic trioxide
ABSTRACT Objective: To compare the changes of gene expression profiles of multiple myeloma cell line RPMI 8226 before and after 24hour intervention of arsenic trioxide. Methods: The responses of the RPMI 8226 cells to arsenic trioxide were determined with cDNA microarray which included 4 096 different human genes. Results: Of these 4 096 genes, the expressions of 273 genes were altered significantly at mRNA level. The expressions of 121 genes were upregulated while the expressions of 152 genes were downregulated. Conclusion: The effect of arsenic trioxide on RPMI 8226 cells is related to changing the expression levels of a number of genes. ZFYVE16, ALK1 and TXNIP genes may play important roles in apoptosis and differentiation of RPMI 8226 cells.
KEY WORDS arsenic trioxide; DNA microarray; multiple myeloma
多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）是一种浆细胞恶性增殖性疾病。由于MM瘤细胞的增殖比例很低及多药耐药的形成，目前临床治疗该病仍十分困难，迄今为止尚无根治的方法。最近的临床资料显示，三氧化二砷对MM有一定的治疗效果，且无严重的毒副作用［1,2］。为探寻三氧化二砷治疗MM的作用机制，本实验应用DNA微阵列技术研究三氧化二砷作用于MM细胞株后对其基因网络的调控作用。
1 材料与方法
1.1 材料 （1）三氧化二砷，购自中国药品公司，样品溶于rpmi 1640培养基（美国Gibco公司产品），灭菌分装备用，存储浓度为35 mg/L，使用时稀释为工作浓度2 μmol/L。（2）RPMI 8226细胞，为人类MM细胞株，由西安交通大学第一医院血液中心提供。
1.2 细胞培养 取RPMI 8226细胞按1×105/ml浓度分别接种于含及不含2 μmol/L三氧化二砷的新鲜RPMI 1640培养基中（内含10%小牛血清、1 mmol/L谷氨酰胺、1 mmol/L丙酮酸、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素），于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h后收集细胞。
1.3 总RNA的提取 按照TRIzol Reagent（美国Gibco公司产品）说明书进行操作，提取RPMI 8226细胞总RNA，采用Oligotex mRNA Midi Kit（荷兰QIAGEN公司产品）纯化mRNA，应用RNA电泳及分光光度仪测定光密度（optic density, OD）值，计算OD260/OD280值以鉴定mRNA质量。
1.4 探针标记 按美国Biostar公司芯片杂交试剂盒说明书操作。分别等量混合未使用三氧化二砷干预的RPMI 8226细胞总RNA及已使用三氧化二砷干预24 h后的RPMI 8226细胞总RNA，各提取50 μg逆转录合成cDNA。采用荧光染料Cy3dCTP标记未使用三氧化二砷干预的RPMI 8226细胞cDNA，Cy5dCTP标记已使用三氧化二砷干预24 h后的RPMI 8226细胞cDNA，S200纯化柱纯化cDNA。
1.5 DNA微阵列制备 DNA微阵列包含4 096个基因cDNA（上海博星基因芯片有限公司提供，型号BiostarH40s），包括癌基因、抑癌基因、细胞信号转导基因、凋亡相关基因及阴性对照等。采用通用引物进行多聚酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）扩增。使用美国Cartesian公司的Cartesian点样仪及美国Telechem公司的硅烷化玻片进行点样。玻片经水合、干燥、紫外线交联后，分别采用2 g/L十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate, SDS）、水和2 g/L硼氢化钠溶液处理10 min，晾干备用。
1.6 杂交及洗涤 DNA微阵列在95 ℃水浴中变性2 min，混合探针在95 ℃水浴中变性30 s，将混合探针加于DNA微阵列上，42℃杂交16～18 h，按顺序使用2×氯化钠/柠檬酸钠（sodium chloride / sodium citrate, SSC）缓冲液加2 g/L SDS、0.1×SSC加2 g/L SDS、0.1×SSC洗涤10 min后，室温晾干。
1.7 MM基因表达谱检测与分析 采用Scan Array 4000扫描仪（美国General Scanning公司产品）扫描DNA微阵列，GenePix Pro 3.0软件分析Cy3和Cy5这两种荧光信号的强度和比值。经两种波长扫描获得的强度值分别代表Cy3和Cy5的数值，计算每个点Cy3/Cy5的比值。
2 结果
2.1 DNA微阵列的质量标准控制 BiostarH40s表达谱DNA微阵列的质量标准：有96个管家基因（阳性对照）和20个内参基因必须为阳性，16个植物基因（阴性对照）和16个点样液（空白对照）必须为阴性。本实验结果完全符合上述条件，说明实验无污染且检测体系正常。
2.2 差异表达基因 先将所有数据的前景值与背景值相减，得出Cy3、Cy5标记的强度值，将所有＜200的强度值用200取代。根据总数为n的有效基因（select值＝1，Cy3、Cy5标记的强度值皆＞200，或者其中1项＞800）Cy5/Cy3比值的自然对数值［InRi＝In（Cy5/Cy3）］，以Ri值在0.1～10的有效基因作为均一化依据，计算这些基因Cy5/Cy3比值自然对数的平均值，即均一化（normalization）系数。将所有数据项的Cy3标记强度值乘均一化系数，得出调整后的Cy3。计算所有基因Cy5/Cy3的比值，列出比值＞2或＜0.5的数据，从中筛选出具有相同Gene ID的数据，在与两种探针杂交时皆表现出一定的差异，且上下调趋势一致。
根据以上筛选标准，RPMI 8226细胞在三氧化二砷处理前后Cy5/Cy3的比值＞2或＜0.5，且同一基因两个重复点表达均有相同变化的共有273个，其中表达上调的基因有121个，表达下调的基因有152个。见表1、2，图1、2。
表1 三氧化二砷干预后RPMI 8226表达上调基因（略）
Table 1 Upregulated genes in RPMI 8226 cell samples after arsenic trioxide intervention
表2 三氧化二砷干预后RPMI 8226表达下调基因（略）
Table 2 Downregulated genes in RPMI 8226 cell samples after arsenic trioxide intervention
图1 Cy5、Cy3荧光标记三氧化二砷干预和未干预RPMI 8226细胞样品叠加图（略）
Figure 1 Superposition maps of Cy5 and Cy3labeled RPMI 8226 cell samples treated with and without arsenic trioxide
On one spot, if Cy3 signal was much stronger than Cy5 signal, it showed green (i.e. downregulation); if Cy5 signal was much stronger than Cy3 signal, it showed red (i.e. upregulation); if the intensities of Cy3 and Cy5 signals were similar, it showed yellow.
图2 三氧化二砷干预与未干预RPMI 8226细胞样品Cy5/Cy3比值散点图（略）
Figure 2 Scatter diagram of Cy5/Cy3 ratios in RPMI 8226 cell samples treated with and without arsenic trioxide
Xaxis and Yaxis represented the fluorescence intensities of Cy3 and Cy5 respectively. Each point in the scatter diagram represented the hybridization signal of corresponding gene in DNA microarray. The red point meant that the Cy5/Cy3 ratio was within the range of 0.5 to 2.0 (with no significant difference in gene expression). The yellow point meant that the Cy5/Cy3 ratio was beyond the range of 0.5 to 2.0 (with significant difference in gene expression).
3 讨论
本研究应用cDNA表达谱芯片技术检测三氧化二砷未干预及干预24 h后RPMI 8226细胞的基因表达差异，探寻三氧化二砷治疗MM的机制。实验结果显示，在4 096个已知基因中差异表达基因273个，其中上调基因121个，下调基因152个，这些基因的功能涉及细胞生命活动的各个方面，如信号转导、蛋白质合成、免疫、代谢、DNA合成及细胞周期等，其中有些基因的功能不详。由于MM基因的表达受网络式调控，各个基因之间的表达是互相影响的，因此三氧化二砷干预后各基因的表达既有上调，又有下调。
B细胞易位基因1（Bcell translocation gene 1, BTG1）是p53的上调基因，属于抗增殖基因，主要调节细胞增殖和分化［3］。此基因首先在B细胞慢性淋巴细胞白血病中被发现，其mRNA长度1.8 kb。有实验表明，BTG1蛋白通过与HOXB9（homeobox protein HoxB9）及蛋白质精氨酸N甲基转移酶1（protein arginine methyltransferase 1, PRMT1）结合，调节其转录活性［4,5］和血管增殖［6］，从而抑制肿瘤细胞的增殖。BTG1蛋白可被无所不在的蛋白酶系统降解，该降解过程又可被特定的蛋白酶抑制剂所终止。本研究结果显示，三氧化二砷干预RPMI 8226细胞24 h后，其BTG1的表达明显上调，推测可能与三氧化二砷抑制相关蛋白酶有关，提示BTG1在RPMI 8226细胞凋亡及分化过程中起重要作用。ZFYVE16基因位于染色体5p15.2q14.3，编码endofin蛋白质，此蛋白质广泛存在于细胞的早期核内体，通过其FYVE功能区与核内体相联系，调节细胞膜的物质交换［7］。Endofin的过度表达可引起核内体网格蛋白（clathrin）增多，导致高频率的核内体融合，这种作用是经由TOM1基因实现的［8,9］。三氧化二砷干预24 h后，RPMI 8226细胞ZFYVE16基因上调，是否由于这种基因的上调导致了RPMI 8226细胞的凋亡，至今仍不清楚；另一个上调的基因是TP53BP1，编码53BP1，可与野生型p53结合以诱导p53依赖蛋白的表达，在信号转导中提高p53的活性［10］。
本实验中，多个与信号转导相关基因的表达下调。如活化素受体样激酶（activin receptorlike kinase 1, ALK1）基因是转化生长因子β（transforming growth factorβ, TGFβ）受体家族成员，主要表达于内皮细胞，诱导Smad1/5磷酸化而使内皮细胞发生增殖和迁移［11］，促进肿瘤生长。肿瘤血管生成时，ALK1表达增高。本研究结果显示，三氧化二砷干预24 h后，ALK1基因表达明显下调，提示三氧化二砷可抑制肿瘤血管的增殖。YES1是一种肉瘤病毒基因，位于染色体18p11.32，编码与细胞膜相关的酪氨酸蛋白激酶，在肿瘤细胞中过度表达［12］，经三氧化二砷作用后其表达水平降低。本实验中，TXNIP（thioredoxininteracting protein）基因表达的下降最为显著。TXNIP编码TXNIP蛋白质，参与组成TXN通路，此通路存在于细胞的多个部位（包括细胞质和线粒体），TXNIP可与TXN紧密结合，抑制其通过尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH）氧化作用减少巯基群的能力［13］。经三氧化二砷干预后，TXNIP基因表达的降低可导致巯基群减少，从而降低线粒体内跨膜电位并激活caspase3酶，开放线粒体膜通透性转运孔，释放线粒体内活性氧及细胞色素C，激活半胱天冬氨酸酶，从而诱导MM细胞的凋亡［14］。
总之，本实验中发现的差异基因，为进一步研究三氧化二砷治疗MM的分子机制提供了具体的线索，尤其是ZFYVE16、TXNIP及ALK1基因表达的改变可能在RPMI 8226细胞的分化及凋亡中起到非常重要的作用，值得进一步研究。
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