SiRNA干扰介导CXCR4基因沉默在抑制恶性淋巴瘤 转移中作用及机理
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摘要：目的 本研究拟通过RNA干扰技术抑制cxcr4基因的表达，并观察其对淋巴瘤细胞侵袭转移能力的影响。方法 设计合成CXCR4 特异性小干扰RNA（sirna），并转染JURKAT细胞。通过qPCR检测CXCR4 mRNA 的表达，用Transwell小室体外细胞侵袭模型检测细胞体外侵袭能力。结果 转染pRNAT-U6.2/Lenti-CXCR4-siRNA的JURKAT细胞CXCR4基因表达明显受抑制；与对照组比较，其细胞侵袭能力亦明显降低。结论 应用RNA干扰靶向沉默技术，高效特异性地抑制淋巴瘤细胞CXCR4 基因的表达，从而抑制肿瘤的侵袭能力。
关键词：恶性淋巴瘤；siRNA ；CXCR4
恶性淋巴瘤是一组原发于淋巴结和（或）结外部位淋巴组织的淋巴细胞或组织细胞的恶性肿瘤。本研究拟通过RNA干扰技术，靶向沉默CXCR4基因的表达，观察其对淋巴瘤侵袭转移的影响。
1材料与方法
1.1材料与试剂 人淋巴瘤细胞株JURKAT由南方医科大学南方医院血液病实验室惠赠；pRNAT-U6.2/Lenti购于GenScript公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购于QIAGEN公司。
1.2细胞培养 JURKAT细胞用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液，于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养，常规换液传代。
1.3质粒载体的构建 利用Takara、AMbion和Promega siRNA靶序列分析设计系统，扫描人CXCR4 cDNA编码序列，依据siRNA靶序列设计原则，经BLAST同源性分析。设计包含XholⅠ和BamHⅠ酶切残端的1对靶向CXCR4发卡样DNA寡核苷酸，由上海生工公司分别合成2对编码短发夹RNA序列的DNA单链，其序列如下：5'-GATCC GGAACCCTGTTTCCGTGAATTCAAGAGA TTCACGGAAACAGGGTTCC TTTTTTC-3' （sense） and 5'-TCGAG AAAAAA GGAACCCTGTTTCCGTGAA TCTCTTGAA TTCACGGAAACAGGGTTCC G-3' （antisense）。 选取其中一个序列打乱并无基因同源性作为阴性对照序列（NC）。其寡核苷酸序列：5'-GTTCTCCGAACGTGTCACGT-3' （sense） and 5'-ACGTGACACGTTCGGAGAAT-3' （antisense），用XhoⅠ和BamHⅠ双酶切空质粒pRNAT-U6.2/Lenti，将退火形成的双链定向克隆至该真核载体上，经筛选后，再进行测序鉴定。
1.4质粒转染及稳定筛选 参照Lipofectamine TM2000转染试剂盒说明书进行转染，通过脂质体将表达载体（pRNAT-U6.2/Lenti-CXCR4-SiRNA）和空质粒（pRNAT-U6.2/Lenti）转染入JURKAT细胞，经G418筛选建立稳定传代的细胞系。
1.5荧光定量PCR检测CXCR4 mRNA表达 采用Trizol法提取细胞总RNA，用AMV反转录酶进行反转录，得到总cDNA。分别扩增目的基因CXCR4及内参对照 -actin，引物序列如下：CXCR4上游引物5'- CAATGACTTGTGGGTGGTTGTG-3'，下游引物5'- ATGCAATAGCAGGACAGGATGA -3'； -actin上游引物5′- TGGCACCCAGCACAATGAA -3′，下游引物5′- CTAAGTCATAGTCCGCCTAG
AAGCA -3′。扩增条件：95℃预变性30s，95℃变性3s，60℃退火和延伸30s，循环40次。记录各管扩增CT值，换算出基因拷贝数。以CXCR4基因拷贝数与 -actin基因拷贝数的比值作为CXCR4相对表达水平。
1.6 Transwell小室侵袭实验 以预冷的RPMI1640与Matrigel胶1：1稀释后，取100μl稀释胶加到Transwell上层小室中，于37℃孵育6h。收集各组细胞，消化成单细胞悬液，用含1%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬，按5×104/ml个细胞的密度将100μl接种于Transwell上层小室。吸取含10%胎牛血清或10%胎牛血清+100ng/ml SDF-1的RPMI1640培养基500μl加入Transwell下层小室，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养24h。用棉签沾PBS轻轻地擦去小室上层聚碳酸酯膜上贴壁生长但未能穿过膜的细胞。将膜取出放入预先装有95%乙醇的24孔板内固定10min。吸弃乙醇，加0.1%的结晶紫染色30min，用PBS小心洗去多余的染料，翻转聚碳酸酯膜，小心撕下，晾干，置载玻片上加中性树胶盖玻片封片。在200倍放大倍数下随机观察并计10个视野内穿过聚碳酸酯膜的细胞数，照相记录。重复3次。
1.7统计学方法 SPSS16.0软件进行统计学处理，各组间比较应用单因素方差分析，检验标准以P
2结果
2.1 JURKAT细胞CXCR4 mRNA的表达 转染pRNAT-U6.2/Lenti-CXCR4-SiRNA的JURKAT细胞中CXCR4 mRNA表达水平均明显降低，与空载体组和空白组相比，差异有统计学意义（P0.05），见表1。
2.2各组JURKAT 细胞体外侵袭能力 空白对照、阴性对照、siRNA 转染组JURKAT细胞的穿膜细胞数分别为（109.30±8.03）、（107.80±9.51）、（54.60±10.06） ，3者比较，差异有统计学意义（F=126.356，P
图1 CXCR4靶向沉默对淋巴瘤细胞JURKAT侵袭能力的抑制作用
3讨论
基质细胞衍生因子-1 （ SDF-1）是趋化因子CXC亚家族的重要成员之一，又名CXCL12，它与其特异性的G蛋白偶联受体CXCR4 具有高度的亲和性。现有的研究表明， SDF-1与CXCR4所构成的受配体系统不仅在细胞的炎症反应、造血干细胞的迁移与归巢等生物学过程中发挥着重要的作用，而且还可能在肿瘤尤其是血液肿瘤的发生以及浸润等环节起着一定的作用[1]。肿瘤转移是一个具有高度组织性和器官选择性的复杂连续过程。虽然已证明很多因素参与肿瘤的转移，但是，不同组织来源的肿瘤细胞迁移、侵袭到特定部位的分子机制还不清楚。研究发现，CXCR4在恶性淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、肺癌、卵巢癌、胶质瘤等肿瘤细胞中的表达增高，CXCR4与其配体SDF-1的相互作用可能在其侵袭转移中发挥着重要作用，因此推断抑制肿瘤细胞表面CXCR4 的表达，干扰SDF-1/CXCR4 的相互作用可能是抗肿瘤侵袭转移的一个比较有意义的靶点和策略。
siRNA可以特异性地剔除或关闭特定基因的表达，被广泛应用于基因功能探索和恶性肿瘤的基因治疗。国外学者用siRNA封闭CXCR4基因后使乳腺癌细胞的侵袭和粘附能力明显下降，将封闭CXCR4基因后的乳腺癌细胞种植入SCID小鼠中可阻止肿瘤的发生，从而说明CXCR4可能控制乳腺癌生长和转移的潜在靶点。
淋巴瘤临床分期是依据肿瘤对淋巴结区和（ 或） 结外器官侵犯范围和程度不同来划分，而临床分期和结外器官受侵的数目与患者的预后明显相关。Trentin 等[2]对21 例非霍奇金淋巴瘤（NHL） 患者研究发现，CXCR4 是唯一在所有患者恶性B细胞均有表达的趋化因子， 并且SDF-1 对此类细胞有趋化作用。用CXCR4 抗体或SDF-1 抗体可抑制NHL 细胞的跨内皮细胞和跨基质细胞迁移，并且抑制其增殖和促进其凋亡[3]。动物实验则发现NOD/SCID小鼠注射Namalwa 细胞后，全部在36d前死于造血异常，此类小鼠若在第3，10，17d 注射100 μg 的抗CXCR4，则7/12的肿瘤可完全去除，5/12肿瘤负荷明显降低，并且未观察到毒性作用。若由此证实，抗CXCR4可抑制NHL细胞的跨血管迁移作用，影响其向骨髓迁移，并且促进NHL细胞凋亡、降低肿瘤负荷，提示CXCR4 抗体及干扰CXCR4 作用的分子在NHL治疗中有一定的临床意义。我们的研究结果表明，转染pRNAT-U6.2/Lenti-CXCR4-SiRNA的JURKAT细胞CXCR4基因表达明显受抑制；与对照组比较，其细胞侵袭能力亦明显降低。
总之，我们应用RNA干扰靶向沉默技术，高效特异性地抑制淋巴瘤细胞CXCR4 基因的表达，从而抑制肿瘤的侵袭能力。由此可见CXCR4在恶性淋巴瘤侵袭、转移的分子机制中扮演重要角色，而靶向CXCR4基因治疗则显示出潜在的疗效和前景。
参考文献：
[1]Muller A， Homey B， Soto H，et al.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis[J].Nature，2001，410：50-56.
[2]Trentin L， Cabrelle A， Facco M， et al . Homeostatic chemokines drive migration of malignant B cells in patients with non2Hodgkin lymphomas[J].Blood，2004，104 （2）：502-508.
[3]Bertolini F， Dell'Agnola C， Mancuso P， et al. CXCR4 Neutralization ， a novel therapeutic approach for non-hodgkin's lymphoma[J].Cancer Res，2002，62（11）：3106-3112.
[4]Reynolds A， Leake D， Boese Q， et al. Rational siRNA design for RNA interference [J]. Nat Biotechnol， 2004， 22（3）： 326-330.
[5]Aoki Y，Cioca DP， Oidaira H， et al. RNA interference may be more potent than antisense RNA in human cancer cell lines [J]. Clin Exp Pharmacol Physiol， 2003， 30（1-2）：96-102.