贝类三倍体育种研究进展

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摘要 综述了贝类三倍体育种的原理、方法、影响因素。在分析国内外研究现状的基础上，展望了贝类三倍体育种未来的发展方向。

P键词 贝类；三倍体；育种；原理；方法；影响因素；意义

中图分类号 S968.3 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）04-0234-03

Abstract This article introduced principles，methods and influencing factors of shellfish triploid breeding.It analyzed the research status at home and abroad，and then put forward essential research considerations related to shellfish triploid breeding.

Key words shellfish；triploid；breeding；principle；method；influencing factor；singificance

贝类具有食物链短、定居性强、养殖和育苗技术完善、养殖成本低等优点，是我国海水养殖的主要种类之一。贝类养殖已成为我国沿海经济发展的主要支柱之一[1]。近年来，贝类养殖研究的热点是利用细胞遗传学技术对贝类的品种进行改良，提升贝类养殖产品的品质和产量。贝类三倍体育种技术通过改变贝类染色体组的方式来改变其遗传基础，使其个体大小、生长速度、抗病能力等形态特点优于普通二倍体个体，遗传特性优良[2-3]。由此，在国内广泛开展对贝类的三倍体育种的研究。

1 贝类三倍体产生的机理

贝类在自然条件下多为二倍体，细胞内含有2组染色体组。研究表明，绝大多数贝类在性成熟后排放出的已经完成2次减数分裂，每个中只含有个体细胞中1/2的染色体数，而排出的成熟卵子一般停留在第一次减数分裂的前期或中期，只有在受精或者其他因素刺激后，卵子才会完成2次减数分裂释放出第一极体和第二极体，随后进入卵裂。贝类卵子减数分裂的延迟现象为贝类三倍体育种提供了条件[4-7]。

获得贝类三倍体的途径主要有2种：一种方式是将二倍体贝类和四倍体贝类进行杂交，从理论上可以100%得到三倍体个体[8-10]；另一种是抑制受精卵第一极体或第二极体的释放，使极体内所含的1组染色体保留在受精卵内，受精卵的染色体增加1组形成三倍体[11-15]。

2 三倍体育种方法

2.1 物理方法

2.1.1 静水压。静水压法是使用水静压设备对处理对象施加压力，抑制其纺锤体的微丝、微管的形成，抑制细胞分裂，抑制极体排出。200～500 kg/s是静水压处理常用的压力范围，处理时间约为10 min，根据物种不同而有所变化[12]。

2.1.2 温度休克。温度休克改变细胞内酶的构型，使细胞内酶促反应的进行受到影响，导致细胞分裂过程中所需的ATP供应途径受阻，使完成减数分裂染色体加倍的细胞不能分裂。温度休克分为热休克和冷休克，所处理的温度因物种不同而有所不同，一般在该物种生存温度范围的上下限[11，16-21]。

2.1.3 低渗。低渗法通过降低受精卵所处的海水盐度进行诱导，导致细胞内能量代谢紊乱，微丝、微管形成受到影响[22-24]，细胞分裂受到抑制。此方法成本低、操作简单、诱导率高，适宜在生产中使用[13]。

此外，还有通过对受精卵施加电脉冲诱导形成三倍体的方法。

2.2 化学法

化学法是在受精卵发育的适当时期使用化学药品进行诱导，使其在第一极体或第二极体释放时受到抑制，从而形成三倍体个体。6-二甲氨基嘌呤（6-dimethylamintpurin，简称6-DMAP）、细胞松弛素B（CytochalasinB，简称CB）、秋水仙素、咖啡因等为常用试剂。这些药物作用的机理不同但都能诱导受精卵抑制正常的细胞分裂形成三倍体[25-28]。

2.2.1 6-二甲氨基嘌呤（6-dimethylamintpurin，简称6-DMAP）。6-DMAP是嘌呤毒素的一种类似物，通过作用于细胞内特定激酶，破坏细胞微管的聚合中心，抑制极体的释放[7，29-31]。6-DMAP易溶于水，低毒，无致癌性，价格低廉且诱导高效，最近在贝类多倍体诱导中代替细胞松弛素B被广泛应用[8]。6-DMAP的适宜浓度范围为300～450 μmml/L，处理时间10～20 min[9]。

2.2.2 细胞松弛素B（CytochalasinB，简称CB）。细胞松弛素B是真菌的代谢产物之一，该药物可特异性地作用于细微丝，导致细胞微丝和肌球蛋白构成的“收缩环”解体，阻止细胞分裂从而抑制极体释放，产生三倍体。细胞松弛素B有剧毒，使用其产生三倍体是通过破坏受精卵的细胞结构而完成的，经过细胞松弛素B处理的受精卵三倍体率很高，也会使处理过的受精卵孵化率降低[5-6]。细胞松弛素B的有效浓度为0.2～1.0 mg/L，一般溶解在二甲基亚砜中使用，处理时间10～15 min[6]。

2.2.3 秋水仙素。秋水仙素能够抑制微管的合成，使已有的微管解聚，阻止纺锤体形成[22]，三倍体得以诱导形成。此药物在植物中应用广泛，但在贝类及其他动物中应用较少。

2.2.4 咖啡因。咖啡因通过提高受精卵细胞内的Ca2+浓度，使对Ca2+浓度极其敏感的微管受到破坏，纺锤丝的形成受到影响，从而抑制细胞分裂形成三倍体。咖啡因的有效浓度、处理时间分别为5～15 mmol/L、10～15 min。咖啡因和热休克处理法结合使用诱导效果更加显著[10，22]。

2.2.5 其他药剂。三氯甲烷、氯化钙、聚乙烯乙二醇等药物对抑制细胞分裂形成三倍体都有一定的作用，但诱导效果较差，很少采用。

2.3 生物学方法

理论上将二倍体贝类和四倍体贝类进行杂交，可以100%得到三倍体个体。此方法操作简便、三倍体率高、避免了理化处理对受精卵的损伤，是理想的产业化养殖育种方式[14]。

此外，人工雌核发育和细胞融合法也可以用于诱导贝类三倍体。

3 影响贝类三倍体育种的因素

影响贝类三倍体育种的因素主要有受精卵处理条件的确定、受精卵发育的同步性和受精卵的密度。

3.1 受精卵的处理条件

多倍体育种过程中，有效的诱导途径和处理时间是育种成功的关键。选择适当的诱导途径，以能够抑制极体释放的最小剂量处理受精卵，可以有效地减小外界处理对受精卵造成的影响。在此基础上对受精卵的发育过程进行详细研究以确定其极体释放的时间点，确定诱导条件的处理时间。综合一定范围内诱导途径与处理时间结果的的差异，决定对同一物种诱导率、幼虫成活率最高的一组条件[15]。

3.2 受精卵发育的同步性

多倍体人工育种是对处于某一特定发育阶段的受精卵进行处理，因而被处理的受精卵之间保持同步性是高效诱导三倍体的关键。受精卵发育的同步性主要与卵子的质量、受精卵发育的温度有关。阙华勇等[17]发现近江牡蛎在25～28 ℃时受精卵发育同步性较高。Uttin等[16]发现菲律宾蛤仔卵的质量与卵子的脂类储量相关，提高卵子的脂类储量有助于增强卵子对CB处理造成伤害的承受能力。

3.3 受精卵密度

在诱导过程中，提高受精卵的密度可以减少诱导用的药物剂量，但卵细胞密度过高会使卵子沉积于容器底部，影响药物与卵细胞的相互作用，降低诱导率[18]。

4 贝类三倍体育种的意义

三倍体细胞是非偶数染色体组，无法正常产生生殖细胞，从而导致个体性腺发育不良或无法发育。不育的三倍体不像正常个体在性成熟阶段发育性腺消耗能量，使个体将更多的能量用于生长。三倍体不育的特点可以使其在生产过程中达到如下目的：①控制贝类养殖过程中的过速繁殖，防止干扰天然资源。②获得生长速度快的三倍体个体，有助于提高经济效益[22]。③通过对二倍体种间杂交不成功的2个良种贝类进行三倍体诱导杂交，整合其优良性状，如温度耐受性、抗病性、生长快速性等。

5 贝类三倍体育种研究进展

关于贝类三倍体研究自1981年Stanley等[19]报道了人工诱导美洲牡蛎三倍体成功以来，取得了快速发展，目前已在30余种贝类中开展了多倍体育种的研究。尤其在近几年，随着对多倍体育种操作的研究深入，一些三倍体贝类在人工养殖过程中表现出多种优良性状。部分三倍体育种技术已经应用于商业化生产，如三倍体牡蛎于美国的产业化。我国贝类三倍体育种项目虽然开展较晚，但在国家863项目支持下，在栉孔贝类、皱纹盘鲍等贝类上开展了研究工作，目前一些种类已经初具产业化规模。

6 贝类三倍体育种研究展望

贝类养殖是我国海水养殖的支柱产业之一，但由于长期以来，养殖贝类由于近亲繁殖、养殖环境污染以及疾病等原因造成了产量的下降，严重影响其快速健康发展。因而希望通过三倍体育种技术培育出生长迅速、抗逆性强的品种，改善贝类养殖业所面临的问题。

我国在贝类三倍体育种方面已经进行了大量的研究并取得了长足进步，但还存在着一些问题。诱导方法上，化学方法诱导效果好，但成本高、具有毒性，对贝类及养殖周边环境都有影响；物理方法操作简单、成本低廉，但诱导效果不好；生物方法所应用的贝类四倍体培育和细胞融合技术仍是一个难题。因此，寻找一种高效、无毒、安全且低成本的贝类三倍体育种方法是今后贝类育种的主要研究方向。

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