论辛伐他汀对新生鼠脑缺氧缺血后海马区一氧化氮合酶的影响

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[论文关键词]脑缺氧；脑缺血；一氧化氮；一氧化氮合酶；辛伐他汀

[论文摘要]目的 探讨新生大鼠缺氧缺血脑损伤(HIBD)后海马区各型一氧化氮合酶(NOS)活性的变化及辛伐他汀对其的调节作用。方法选用7日龄SD大鼠，随机分组、建立新生大鼠HIBD模型后，于不同时间点剥取脑海马，测定各型NOS的变化并比较各组之间的差别。结果 HIBD后生理盐水组诱导型NOS(IN0s)活力水平于12 h时始显著增高，48 h达高峰，7 d时接近假手术组水平(P>0.05)，12 h、24 h、48 h、72 h时胞二磷胆碱组、辛伐他汀组明显低于生理盐水组，72 h时，辛伐他汀组显著低于胞二磷胆碱组(P<0.01)。生理盐水组结构型N0s(cN0s)水平于0 h即显著升高，然后逐渐下降，72 h时接近假手术组水平，而胞二磷胆碱组、辛伐他汀组仍继续增高，48 h达高峰，但辛伐他汀组升高更显著。结论 各型NOS均参与了HIBD的发病过程，辛伐他汀和胞二磷胆碱对新生大鼠HIBD的保护作用与其调节NOS有关，且辛伐他汀的作用更强。

一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)是合成一氧化氮(NO)的关键酶，根据其最早的克隆细胞或组织来源分别称为：神经元型NOS(nNOS)、内皮型NOS(eNOS)和诱导型NOS(iNOS)。nNOS及eNOS在生理状态下即有表达，无需诱导产生，统称为结构型NOS(cNOS)。不同亚型的NOS在脑缺氧缺血损伤中的作用不同，eNOS产生的NO有神经保护作用，nNOS与iNOS产生的NO与神经损伤有关。本实验通过观察新生大鼠缺氧缺血脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)后海马区各型NOS活性的变化以及辛伐他汀对其的影响，以探讨辛伐他汀对新生大鼠HIBD的保护作用及可能机制。

1材料与方法

1．1 实验动物分组和模型的制备

144只出生7d的Sprague-Dawley大鼠，雌雄不限，体质量(12.12±2.13)g，由上海复旦大学提供鼠种，东南大学临床医学院实验动物中心繁殖。随机分为假手术组(sham组)、生理盐水组(saline组)、胞二磷胆碱组(CDPC组)和辛伐他汀组(simvastatin组)，每组再分0，12，24，48，72 h、7d共6个时间点，每个时间点各6只。按Rice方法，制作成HIBD模型后，分别于即刻及之后的每天同一时刻，生理盐水组腹腔注射生理盐水10mI·kg，胞二磷胆碱组腹腔注射胞二磷胆碱稀释液(胞二磷胆碱15 ml＋生理盐水85 m1)10 ml/kg，辛伐他汀治疗组腹腔注射辛伐他汀(瑞典ALEXIS产品)20 mg/kg，每日一次，注射天数根据各组要求而定。假手术组仅手术游离左侧颈总动脉但不结扎，不再进行缺氧及药物干预等处理。

1．2脑组织的提取及NOS活力的测定

到预定时间点后断头取左脑，冰盒上迅速剥取海马，在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸吸干，放人液氮中，当时不用可放入-70℃中保存。将海马放入玻璃匀浆器，加入9倍的生理盐水，制备成10％的组织匀浆，3000 r/min，离心10min，取上清各50μl分别用于测总NOS、iNOS吸光度值及蛋白含量，然后根据公式计算总NOS及iNOS的活力，cNOS活力为总NOS活力减去iNOS活力所得。试剂盒购自南京建成生物工程研究所，用752型分光光度计进行比色测定，每毫克组织蛋白每分钟生成1 nmol为一个酶活力单位(U/mg)。

1．3统计学分析

用SPSS11.0统计软件包进行统计分析，计量资料以均数±标准差(χ±s)表示。多组之间的比较采用方差分析，当方差分析有显著性差异时，进一步用q检验作两两比较。以检验水准取a＝0.05，当P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2．1 结扎侧海马区不同时间点各干预组的iNOS检测结果

在结扎侧海马区，生理盐水组、胞二磷胆碱组和辛伐他汀组iNOS活力在HIBD后12 h始升高，48 h达高峰，然后开始下降，到7 d时，各干预组iNOS的活力下降至接近正常水平，和假手术组相比差异无统计学意义(P>0.05)。在0 h时，各干预组iNOS活力与假手术组相比差异无统计学意义(F＝0.498，P>0.05)，在12、24、48、72 h各时间点，胞二磷胆碱组和辛伐他汀组iNOS活力均显著低于生理盐水组(JP<0.01)，在72 h，辛伐他汀组iNOS活力显著低于胞二磷胆碱组(P<0.01)，但仍显著高于假手术组(P<0.05)。各组海马区iNOS活力检测结果。

2．2结扎侧海马区不同时间点各干预组的cNOS检测结果

在结扎侧海马区，生理盐水组、胞二磷胆碱组和辛伐他汀组cNOS的活力在缺氧缺血后0 h始升高，saline组与假手术组相比差异有统计学意义(P<0.01)，但CDPC组及simvastatin组与假手术组相比差异无统计学意义(P>0.05)。saline组cNOS水平自12 h始回落，48 h时与假手术组相比已无统计学意义(P>0.05)，而CDPC组及simvastatin组cNOS水平仍继续升高，48 h达高峰，然后开始下降，到7 d时，仍明显高于sham组(P<0.05)。CDPC组和simvastatin组cNOS水平在Oh时显著低于saline组(P<0.01)，在12 h时与saline组相比无统计学意义(P>0.05)，24 h、48 h、72 h时显著高于saline组(P<0.01或JP<0.05)，7 d时，simvastatin组和CDPC组与saline组相比较差异无统计学意义(P>0.05)，且simvastatin组cNOS水平在48 h、72 h时显著高于CDPC组(P<0.01)。各组海马区cNOS活力检测结果。

2．3假手术组不同时间点的NOS测定结果

假手术组结扎侧海马区域iNOS和cNOS活性在手术后第0、12、24、48、72小时和7天各个时间点的数值经方差分析，差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

不同亚型的NOS在脑缺氧缺血后的变化规律不同，在脑缺血的初期，由eNOS产生的适量一氧化氮具有神经保护作用，而由nNOS产生的一氧化氮具有神经损伤作用；在晚期，iNOS导致迟发性神经元死亡，本实验结果显示，HIBD后在海马部位，iNOS活性于12 h开始明显高于假手术组(P<0.01)，48 h达高峰，7 d时回落到正常水平。而cNOS在HIBD后即刻已显著高于假手术组水平(P<0.01)，然后逐渐下降，到48 h时和假手术组相比差异无统计学意义(P>0.05)。这说明HIBD后不同亚型的NOS是在不同的阶段参与了HIBD的发病过程，cNOS主要在HIBD早期发挥作用，而HIBD后期主要是iNOS表达增多。这种表达差异的原因可能是cNOS的活性为钙和钙调蛋白依赖性，受细胞内Ca2浓度生理性调节，iNOS是钙和钙调蛋白非依赖性酶，主要受一些细胞因子的诱导而激活。这提示笔者在HIBD的防治过程中，nNOS抑制剂和eNOS调节剂应预防应用或在HIBD早期使用，iNOS抑制剂的使用也应在HIBD后12 h内开始，且疗程不应少于7 d。

本实验结果显示，胞二磷胆碱组和辛伐他汀组iNOS活性的变化趋势和生理盐水组相似，也于HIBD后12 h始显著升高，48 h达高峰，然后开始下降，到7d时接近假手术组水平。但iNOS活性上升的幅度显著减小，在12 h、24 h、48 h、72 h各时间点，胞二磷胆碱组和辛伐他汀组iNOS活性均显著低于生理盐水组(P<0.01)，但辛伐他汀对iNOS的抑制作用要强于胞二磷胆碱，在72 h，辛伐他汀组iNOS活性显著低于胞二磷胆碱组(P<0.01)，这说明在HIBD后应用胞二磷胆碱和辛伐他汀均能降低iNOS的表达，从而减少iNOS所致的神经元迟发性损伤，但辛伐他汀的作用更显著，这提示：在防治HIBD时应用辛伐他汀抑制iNOS活性来减轻脑损伤可能会收到较好的效果。

在HIBD后，胞二磷胆碱组和辛伐他汀组cNOS活性的变化规律不同于生理盐水组，虽在oh时cNOS活性也显著升高，但两组均显著低于生理盐水组，此后，cNOS活性没有像生理盐水组那样逐渐下降，而是继续上升，48 h时达高峰，然后开始下降，7 d时仍显著高于假手术组，但与生理盐水组无明显区别(P>0.05)。胞二磷胆碱组和辛伐他汀组eNOS水平在12 h时与生理盐水组相比无统计学意义(P>0.05)，24 h、48 h、72 h时显著高于生理盐水组(P<0.01)。在48 h、72 h辛伐他汀组cNOS活性显著高于胞二磷胆碱组(P<0.01)。分析原因可能为eNOS由nNOS和eNOS组成，两种酶的表达规律不同，HIBD后nNOS活性升高和达到高峰较早，3 h左右达高峰，而eNOS一般24 h左右达高峰。本实验HIBD后eNOS活性的即刻升高主要为nNOS所致，而胞二磷胆碱组和辛伐他汀组显著低于生理盐水组，说明胞二磷胆碱和辛伐他汀对nNOS的活性可能有抑制作用。12 h后胞二磷胆碱组和辛伐他汀组eNOS活性没有像生理盐水组那样逐渐下降，而是继续上升，可能主要与eNOS活性升高有关，提示胞二磷胆碱和辛伐他汀能增高eNOS活性，且辛伐他汀对eNOS活性的调节能力强于胞二磷胆碱。

辛伐他汀是他汀类降脂药中的一种，他汀类药除了具有降脂功能外，还具有改善内皮功能、抑制炎症反应等作用。Vaughan和Delanty对辛伐他汀保护脑功能机制的研究发现，辛伐他汀可以上调内皮性一氧化氮合酶、抑制诱导性一氧化氮合酶、抑制细胞粘附分子间相互作用这一环节而发挥独特抗炎作用，具有抗氧化剂的特性可以降低氧化应激反应。本实验提示，在缺氧缺血脑损伤后应用辛伐他汀可以合理调节NOS亚型活性，从而起到很好的神经保护作用。