念珠菌对两种抗真菌药物的敏感性对比分析
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摘要：目的 检测念珠菌对2种抗真菌药氟康唑、伊曲康唑的体外药物敏感性，指导临床选择敏感的抗真菌药物。方法 实验受试菌株共40株，均来自于2013年1月～2014年11月我院皮肤科患者送检的标本，均证实为念珠菌。用M27-A2法测试念珠菌对氟康唑、伊曲康唑的敏感性。结果 结果显示氟康唑、伊曲康唑对念珠菌的敏感率分别为75.5%、67.5%。结论 氟康唑、伊曲康唑对念珠菌均具有较好的敏感性，本实验结果显示两者无明显差异，因氟康唑价格相对低廉，且对念珠菌的抗菌作用较好，仍可作为念珠菌感染的主要治疗药物。
关键词：念珠菌；抗真菌药；药敏试验
念珠菌属一共含有163种菌种，存在于正常人的皮肤、呼吸道、消化道以及泌尿生殖道等部位，是人体的正常菌群，属于条件致病菌。随着广谱抗生素的广泛应用及宠物饲养量不断增多，皮肤真菌病的发病率有逐年增多的趋势。且病原菌感染的类型、致病病菌等，也呈现出明显的地区差异[1]。对此，本文选择最常用的M27-A2法进行对比，选择的药物为目前应用较多的氟康唑以及伊曲康唑，从念珠菌对两种抗真菌药的敏感性以及耐药性的差异，为临床念珠菌病（candidiasis）发现耐药菌株以及治疗提供依据。
1 资料与方法
1.1一般资料 所用40株受试菌株，均来自于2013年1月～2014年11月我院皮肤科患者送检的标本临床分离株。按常规方法及科玛嘉念珠菌显色培养基联合进行菌株鉴定。以沙氏培养基4℃冰箱保存。质控菌株采用CLSI推荐的质控株。所选药物均由厂家直接提供，所有药物均在有效期内。
1.2方法 根据CLSL/NCCLS推荐的酵母微量稀释法抗真菌药物敏感试验参考方案M27-A2[2]严格进行操作，对分离的念珠菌进行氟康唑、伊曲康唑敏感性试验，方法如下。
1.2.1药液的配置 实验前，分别将配置好的贮存的药液取出，置35℃温箱孵化解冻。然后用稀释液RPMI-1640（内含1%葡萄糖）进行倍比稀释，三种药液的配置如下：①氟康唑：取药液先作1∶9稀释，得到10倍终浓度（128 μg/ml），然后将药液以2倍梯度倍比稀释，得到10个梯度实验浓度的药液。氟康唑的终质量浓度范围在0.125～64 μg/ml。②伊曲康唑：取药液先作1∶9稀释，得到10倍终浓度（160 μg/ml），再次作1∶9稀释，得到10倍终浓度（16 μg/ml），然后将药液以2倍梯度倍比稀释，得到10个梯度实验浓度的药液。伊曲康唑的终质量浓度范围为0.0313～16 μg/ml。
1.2.2受试药敏板的制备 ①在无菌96微孔板中用加样枪每行从第2～12孔每孔分别加入配置好的（1～5）×103CFU/ml二倍终浓度菌悬液100 μl；②从第2～11孔，每孔加入药液100 μl，第1、2、3行的药液分别为氟康唑、伊曲康唑，浓度按配置好的浓度范围由高到低；③第12孔加不含药的RPMI1640液基100 μl（作阳性对照）；④第1孔加入不含药的RPMI1640液基200 μl（作阴性对照）。
1.2.3质控药敏板的制备 方法同受试药敏板。质控株MIC结果稳定，质控株包含在每一次药敏试验中。
1.2.4培养 将制备好的药敏板加盖后置35℃恒温培养箱中进行孵育，培养48 h，进行结果判定。
1.3结果判定 评分标准：与生长对照孔相比肉眼观察完全透明或未见生长为0分；雾状混浊为1分（念珠菌80%生长受抑制）；浊度明显降低为2分（念珠菌50%生长受抑制）；浊度轻度下降为3分；浊度未降低为4分。遇有团块、颗粒形成时用吸打、混悬器等技术分离混匀。本试验对Itraconazole、Fluconazole采取评分1分（即80%生长受抑制，肉眼观察为雾状混浊）为判定终点基准MIC。当药物的MIC值超过或低于测定范围时，按以下方法进行统计：当MIC值高于最高浓度64 μg/ml或16 μg/ml时，按≥64 μg/ml或≥8 μg/ml计算，记为耐药；当MIC值为最低浓度以下时，则按≤0.03 μg/ml或≤0.0125 μg/ml计算，记为敏感。
1.4统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，采用χ2检验对两种药敏试验方法进行对比分析。
2 结果
对于念珠菌对药物的敏感性，本研究现采用M27-A2方案对临床应用较早、价格相对低的氟康唑与近些年应用较广的伊曲康唑作对比分析。念珠菌对两种药的敏感性实验结果，见表1。
用SPSS对其进行χ2检验，χ2=0.600，P=0.438，P>0.05，表明两种药物对念珠菌的敏感性无明显差异，对念珠菌而言两者都是很好的抗菌药物。这与有些文献报道不符，考虑可能为样本量小或地区念珠菌敏感性差异有关。
3 讨论
本实验分别采用M27-A2法，测定40株临床分离念珠菌MIC值，试验表明，大多数菌株对所测的唑类药物是敏感的。氟康唑应用于念珠菌之间的体外药敏试验研究最多。NCCLS的判定折点为：MIC≤8 mg/L敏感，16～32 mg/L是中介性敏感（I），≥64 mg/L则为耐药。本药敏试验结果显示75.5%的念珠菌对氟康唑敏感性较好，低于部分文献报道[3]，考虑可能与念珠菌的耐药性增加相关，但是有研究报道药敏试验提示耐药者仍有对治疗反应良好的现象。伊曲康唑用于念珠菌的体外药敏试验的研究相对氟康唑较少。M27-A规定的判定折点为MIC≤0.125 mg/L为敏感，0.25～0.5 mg/L为S-DD，≥1 mg/L则为耐药。MIC为S-DD和耐药的菌株对伊曲康唑的反应差。
近几年，由于念珠菌感染的发病率和耐药率逐年增多，甚至较少见的头癣也时常见到，它主要通过人与人、人与患病动物相互接触而引发[4]。为了提高对真菌病的诊断和治疗水平，临床微生物实验室需密切配合临床，做好真菌的常规检验的同时，应积极开创和改进真菌药敏试验方法，氟康唑、伊曲康唑对念珠菌均具有较好的敏感性，本实验结果显示两者无明显差异，因氟康唑价格相对低廉，且对念珠菌的抗菌作用较好，仍可作为念珠菌感染的主要治疗药物。此外，临床医生也应提高对药物敏感性测定的重要性认识，应用药敏试验，选择敏感的药物，减少耐药菌的出现。
参考文献：
[1]王迎林，陆祖萍，项彤，等.宁波地区浅部真菌病3637例致病菌的菌种分析[J].中国皮肤性病学杂志，2012，26（10）：900-901.
[2]王端礼.医学真菌学实验室检验指南[M].1版.北京：人民卫生出版社，2005：103-104.
[3]Brunella Posteraro，Rosa Martucci，Marilena La Sorda.Reliability of the Vitek 2 Yeast Susceptibility Test for Detection of In Vitro Resistance to Fluconazole and Voriconazole in Clinical Isolates of Candida albicans and Candida glabrata[J].Journal of Clinical Microbiology， 2009，47（6）：1927-1930.
[4]Ali，Rezaei-Matehkolaei Koichi，Makimura G Sybren，de Hoog Mohammad Reza，et al.Multilocus differentiation of the related dermatophytes Microsporum canis，Microsporum ferrugineum and Microsporum audouinii[J].Journal of medical microbiology，2012，61（Pt 1）：57-63.