不同配比微生物毒性传感器对河豚毒素毒性的测定及与HPLC法比较

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摘要：河豚毒素传感器响应性能与固定化菌体的量和辅料的量都有一定关系。设计微生物量为10 μL，不加辅料及加入1%、2%辅料3种微生物膜，以夹层法固定微生物膜，以氧电极为换能器，分别组装微生物传感器，通过测定传感器的线性范围、线性相关系数以及加标回收率等获知固定化膜的通透性的好坏和响应信号的大小，最后确定3种组合中较优膜为10 μL菌悬液加入1%的辅料。以最优膜组装毒性传感器与高效液相色谱方法的对照发现两者的差异不显著，表明试验建立的毒性微生物传感器方法可以很好地测定河豚毒素的毒性。

关键词：河豚毒素;毒性传感器;HPLC法;微生物膜

中图分类号：S852.4+4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）20-4952-03

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2014.20.048

Biosensor Monitoring Tetrodotoxin with Toxicity Sensor of Different Ratio Microbes

and Comparison with HPLC Methods

CHEN Jing， YANG Zhuo

（Environmental Management College of China， Qinhuangdao 066004， Hebei，China）

Abstract： Tetrodotoxin sensor response performance is closely related with the amount of immobilized bacteria and accessories. Three kinds of microbial membrane were designed. The first one was 10 μL microbial without no accessory material. The second one was 10 μL microbial with 1% accessory material. The third one was 10 μL microbial with 2% accessory material immobilized by sandwich immobilization. A biosensor was fabricated based on oxygen electrode. By measuring the linear range， the linear correlation and the reclaim rate of the two sensor， the property of membrane and value of the response signal was found out. Results showed that 10 microbial with 1% auxiliary materials was the optimal combination of the two membrane. The toxicity sensor was assembled with the optimal membrane and compared with HPLC method. The results showed that the difference between the two methods was not significant. The toxicity microbial sensor method could accurately measure TTX.

Key words： tetrodotoxin; toxicity sensor; HPLC; biofilm

河豚毒素（Tetrodotoxin，简称TTX）是一种强神经毒素，目前河豚毒素检测的标准方法是小鼠生物测定法[1]，其他的检测方法如高效液相色谱法[2]、免疫学方法[3]也日渐成熟。微生物传感器方法[4]由于其方法快捷迅速、价格低廉，越来越成为河豚毒素检测方法研究的重点。有文献报道[5-8]，以地衣芽孢杆菌作为响应菌株，采用夹层法制备微生物传感器测试其对河豚毒素的响应情况，在浓度10～100 μg/L范围内线性较好。

传感器响应性能与固定化菌体的量和辅料的量都有一定关系。在提高微生物膜的重现性及测量范围的可行性问题上设计微生物量为10 μL和辅料量分别占湿菌体0%、1%、2% 3种组合的微生物膜的性能测试。通过测定传感器的线性范围、线性相关系数以及加标回收率等获知固定化膜的通透性的好坏和响应信号的大小，确定菌体和辅料的最佳配比。为了验证地衣芽孢杆菌毒性传感器性能，将毒性传感器方法与河豚毒素的高效液相色谱检测方法对比，测试毒性传感器测量的准确性。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

GGA标准溶液：取质量浓度均为150 mg/L的葡萄糖溶液和谷氨酸溶液，等体积混合，溶液中BOD5的质量浓度为（198±30.5） mg/L。

试验底液（磷酸盐缓冲溶液）：分别称取KH2PO4、Na2HPO4・12H2O 0.4539、5.970 g，用1 200 mL蒸馏水稀释溶解，pH 7.6。

TTX贮备液：称量TTX 1.0 mg溶于10.0 mL 的去离子水中，此时溶液浓度为100 mg/L，浓度较高，较易保存，将此作为TTX贮备溶液，4 ℃保存待用。

TTX标准溶液的配制：由TTX标准贮备液分别稀释配制成10、20、45、50、75、100 μg/mL系列标准溶液，现用现配。

培养基：牛肉膏 0.5 g、蛋白胨 0.5 g、可溶性淀粉 0.5 g、氯化镁 0.1 g、蒸馏水100 mL，pH 7.0。

醋酸纤维素膜（北京化工学校附属工厂）;特快超能胶（汉高粘合剂有限公司）;河豚毒素标准品（分析纯，河北省水产研究所）;甲醇 （色谱纯，天津市康科德科技有限公司）;醋酸（色谱纯，天津市康科德科技有限公司）;试验所用水为石英二次去离子水。

1.2 试验方法

1.2.1 固定化微生物膜的制作 用微量取液器分别吸取一定配比菌悬液滴在生物膜上，采用夹层法将两层膜边粘合起来，保存以备用。

1.2.2 试验流程 按图1组装河豚毒素毒性传感器。在35 ℃，pH 7.6，以 GGA质量浓度为21.5 mg/L的试验底液稳定一段时间，记录稳定后的电流值I0。然后将一定体积的毒素溶液加入底液中，等待新的平衡，记录再次稳定后的电流值It，通过试验可知电流的变化ΔI（ΔI=ItI0）与TTX的量成一定比例关系，得到TTX浓度～ΔI的线性关系曲线图。

1.2.3 最优膜的设计 制备3种组合的微生物膜，组合比例分别为①10 μL湿菌体+0辅料、②10 μL湿菌体+1%辅料③10 μL湿菌体+2%辅料，分别组装河豚毒素的毒性传感器。试验条件均为为：35 ℃、pH 7.6，底液中GGA质量浓度为21.5 mg/L[5]，进行如下3个试验：

Ⅰ精密度测试：平行6次测定传感器对质量浓度为50 μg/L TTX溶液的响应信号，计算测量的平均值、标准偏差及变异系数。

Ⅱ标准曲线的绘制：测定3种类型毒性微生物传感器对不同浓度TTX溶液的响应情况，得到的标准曲线，线性响应范围、线性方程及线性相关系数。

Ⅲ加标回收率试验：取TTX样品做加标回收率试验。

1.2.4 高效液相色谱测试条件的选择

1）流速的选择。选择流动相为醋酸和去离子水，设定总流速为8.000 mL/min，试验醋酸流速为0.799、0.798、0.796、0.792、0.790、0.788、0.785、0.783、0.780 mL/min时基线稳定情况和TTX分离情况。

2）保留时间。流动相为醋酸和去离子水，在上述确定的流速下向液相色谱仪中注射浓度为50、75、100 μg/mL的TTX标准溶液，观察液相色谱图，确定其保留时间。

3）检测波长的选择。流动相为醋酸和去离子水，在上述确定的流速、保留时间下测定波长分别为220、225、230、235、240 nm 的出峰情况，找到在上述色谱条件下TTX的最大吸收波长。

2 结果与分析

2.1 传感器方法最优膜的确定

3个试验测试结果见表1，3种毒性传感器的响应曲线见图2。如表1及图2所示，3种固定化方法的线性范围都在10～80 μg/L之间，线性相关系数都在0.96以上;精密度和准确度都满足毒性测量的要求，都可用于微生物传感器对河豚毒素的毒性测试，但是加入1%辅料的微生物膜精密度高于其他配比的膜，线性相关系数也比其他配比膜好，制备的微生物膜性能优于其他配比的微生物膜，是这3种配比微生物膜中的较优膜。10 μL菌悬液加入1%的辅料是制备地衣芽孢杆菌毒性微生物膜过程中菌液与辅料的最佳配比。

2.2 HPLC条件的确定

试验确定高效液相色谱条件为：ODS柱（150 mm×6 mm，5 μm），流动相为醋酸和去离子水，醋酸流速为0.798 mL/min，去离子水流速为0.002 mL/min，检测波长230 nm;TTX保留时间为8.5 min;室温。

2.3 HPLC标准曲线

配制浓度分别为10、20、45、50、75 100 μg/mL TTX系列标准溶液，按照“2.2”的色谱条件，各进样10 μL，记录在此色谱条件下各系列标准毒素的峰面积，以峰面积为纵坐标，河豚毒素浓度为横坐标，绘制高效液相色谱法测定河豚毒素标准曲线见图3。如图3所示，TTX在浓度20～100 μg/mL范围内线性关系良好，线性回归方程为y=680.93x-4 544.20，相关系数为0.995 6。

2.4 两种测试方法结果比较

在“2.2”确定的色谱条件下向液相色谱仪中注射10 μL未知浓度的TTX样品，测定未知样品的峰面积，利用图3的标准曲线y=680.93x-4 544.20计算出样品浓度;以最优膜组装毒性传感器，试验测得未知样品稀释1 000倍后电流差值I，标准曲线的回归方程为y=0.002 5x+0.012 2，由此可以计算出稀释后的样品浓度，两种测定方法对同一未知样品的测定结果见表2。两种测定方法的结果用SPSS软件进行显著性t检验，可知P>0.05，两者的差异不显著，两种测定方法对样品的测定结果有很好的一致性。

3 小结与讨论

试验测试了10 μL菌悬液加入0%、1%、2%3种微生物组装的传感器对河豚毒素的响应，结果表明，这3种微生物传感器都可满足微生物传感器测试毒性的要求，10 μL地衣芽孢杆菌菌悬液加入1%辅料制膜组装的传感器性能最优。在实验室自有的条件下，利用高效液相色谱法测定TTX的毒性，通过试验得到最佳的色谱条件为：分析柱为ODS柱（150 mm×6 mm，5 μm），流动相：醋酸和去离子水，流速分别为0.798 mL/min和0.002 mL/min，检测波长：230 nm;TTX保留时间为8.5 min;室温;在此色谱条件下，测得TTX浓度在20～100 μg/mL范围内线性关系良好，线性回归方程为y=680.93x-4 544.20，相关系数为0.995 6。同时利用课题装的地衣芽孢杆菌毒性微生物传感器和高效液相色谱法测定未知浓度的TTX的毒性。通过结果对比，高效液相色谱法与微生物传感器的测定结果有很好的一致性，试验建立的微生物传感器方法可以很好的测定河豚毒素浓度，但是仍有许多不足之处有待进一步研究，比如传感器的稳定性和响应范围，微生物膜固定化技术的优化等，可以作为下一阶段研究的重点。

参考文献：

[1] 段发淼，谢心磊，朱宝平.用小鼠单位法检测河豚毒素[J].中国卫生检验杂志，2000，8（4）：463-464.

[2] 舒 静，李柏林，欧 杰.离子色谱法定量检测酒曲发酵液中的河豚毒素[J].色谱，2011（2）：187-190.

[3] 丛 蕾，王锡昌，刘 源，等.河豚毒素免疫抗原的制备及其表征体系的建立[J].中国预防兽医学报，2010（6）：41-494.

[4] 黄 正，任 恕.微生物传感器在污染物生物毒性分析中的应用[J].传感器技术，2004，23（9）：4-6.

[5] 崔建升，陈 婧，王 芳，等.微生物传感器测定河豚毒素研究[J].海洋环境科学，2009（6）：726-728.

[6] 陈唯真，朱维华，俞如英.hplc法测定河豚毒素的含量及稳定性[J].药物分析杂志，2004，24（1）：41-43.

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