川贝母多倍体诱导条件的优化及含量测定
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摘要：采用正交试验法考察秋水仙素浓度、浸泡时间、二甲基亚砜体积分数、处理温度对川贝母（Fritillaria cirrhosa）愈伤组织多倍体诱导的影响。以多倍体诱导率为指标，用正交试验表L9（34）进行试验，筛选最佳诱导条件。在考察的因素中，对川贝母多倍体诱导率影响的大小次序依次为秋水仙素浓度>浸泡时间>二甲基亚砜体积分数>处理温度。多倍体诱导条件的最优组合是秋水仙素浓度为900 mg/L、浸泡时间为48h、二甲基亚砜体积分数为4%、处理温度为20 ℃，在此条件下，其诱导率可达94.3%;细胞染色体鉴定结果为四倍体染色体数为2n=4x=48，诱导后的愈伤组织为多倍体;对野生、组培二倍体、组培多倍体川贝母鳞茎进行有效药用成分生物碱总含量测定，其中组培多倍体生物碱总含量最高为0.657%。
关键词：川贝母（Fritillaria cirrhosa）;愈伤组织;多倍体;生物碱;正交试验
中图分类号：Q813.1+2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）20-4903-05
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2014.20.034
Optimizing the Conditions of Inducing Polyploid of Fritillaria cirrhosa
and Content Determination
JIANG Ming-shu1，2，WANG Yue-hua2，LIU Tao2，FAN Wen-ping2，YANG Min2，WANG Xiao-rong3
（1. Life Science College，Sichuan Normal University，Chengdu 610101， China;2. Chengdu Faculty of Biotechnology Institute，Chengdu University，Chengdu 610106， China;3. Enwei Investment（Group） Ltd. Corporation，Chengdu 610200， China）
Abstract：The induction rate of optimized conditions of Fritillaria cirrhosa including the concentration of colchcine，the time of being soaked in colchcine，the volume fraction of dimethyl sulfoxide and temperature was determined by orthogonal text. A optimal combination was screened through the crossed test of L9（34）. The order of factors affecting the induction rate was the concentration of colchcine> the time of being soaked in colchcine> the volume fraction of dimethyl sulfoxide> temperature. The optimal combination was the concentration of colchcine 900 mg/L，the time of being soaked in colchcine 48 h，the volume fraction of dimethyl sulfoxide 4%，temperature 20 ℃， with induction rate of 94.3%. Compared with the chromosomal number，it was proved that the callus of F. cirrhosa was polyploidy. The contents of total bio-medicinal ingredients with wild，tissue culture of diploid and polyploid bulbs of F. cirrhosa were effectively determinated. The total alkaloid content of polyploid bulbs of F. cirrhosa was the highest with up to 0.657%.
Key words：Fritillaria cirrhosa ;callus;polyploidy;alkaloid;orthogonal test
川贝母（Fritillaria cirrhosa）为名贵川产道地药材，主要用于治疗肺热燥咳、痰多胸闷等症，主要分布于我国西南部横断山区海拔2 800～4 700 m的高山灌丛或草地中。
目前川贝母药用资源短缺，但有报道称药用植物多倍体可大幅度提高药材的产量[1-3]。多倍体植物往往具有器官巨大的特点，并且由于细胞染色体加倍，染色体上基因调控产生的有效化学成分含量也往往较正常二倍体高。因此通过组织培养与多倍体诱导相结合的方式生产其药用活性成分总生物碱，以缓解需求与药材供给、资源枯竭之间的矛盾。
1 材料与方法
1.1 材料
二倍体组培愈伤组织来自成都大学组培室，市售川贝母鳞茎购于成都市同仁堂药店。
1.2 仪器与试剂
超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司;紫外分光光度计，上海实验仪器厂有限公司;电子天平，北京赛多利斯天平有限公司;立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂;多段可编程光照培养箱，宁波东南仪器有限公司;数显恒温水浴锅，常州澳华仪器有限公司;西贝母碱：中国食品药品检定研究院，批号20110706;乙醇（95%）：分析纯AR，成都市科龙化工试剂厂，批号20110823;甲醇：分析纯AR，成都市科龙化工试剂厂，批号20100213;三氯甲烷：分析纯AR，成都市科龙化工试剂厂，批号20110524;浓氨水：分析纯AR，成都市科龙化工试剂厂，批号20120220;溴甲酚绿：成都市科龙化工试剂厂，批号20101028;磷酸二氢钾：分析纯AR，成都市科龙化工试剂厂，批号20121117;氢氧化钠：分析纯AR，成都市科龙化工试剂厂，批号20090228;水为去离子水。
1.3 方法
1.3.1 正交试验因素与水平 王强等[4]、 王跃华
等[5]采用单因素试验考察了秋水仙素浓度、浸泡时间对川贝母愈伤组织多倍体诱导的影响，但是影响多倍体诱导的因素很多，而单因素试验不能综合考虑各个因素的影响，因此本试验采用正交试验法。试验选择了秋水仙素浓度、二甲基亚砜体积分数、浸泡时间、处理温度4个因素，每个因素取3个水平，采用正交试验L9（34）进行试验（表1）。
1.3.2 愈伤组织的诱导 在超净工作台上，将川贝母无菌鳞茎切成0.8 cm见方的小块，接种到愈伤组织诱导培养基MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.3 mg/L+蔗糖30 g/L中，每天光照12 h，光照强度为1 200 lx，培养温度为21 ℃，30 d继代培养一次。
1.3.3 多倍体的诱导 按照表2的设计，进行9组试验。在超净工作台上，将川贝母愈伤组织切成0.8 cm见方的小块， 放入含不同浓度（600～1 200 mg/L）秋水仙素和添加了二甲基亚砜的混合溶液中，浸泡时间为24～48 h，处理温度为15～25 ℃。每组试验浸泡30块川贝母愈伤组织。
1.3.4 多倍体的培养 按照正交设计作不同的处理，处理结束后用无菌去离子水冲洗3次，转接入不含秋水仙素的增殖培养基MS+2，4-D 0.6 mg/L+KT 1.0 mg/L+蔗糖30 g/L中让其恢复生长，每组接15瓶， 每瓶2块。 先暗培养5 d， 之后再进行光照培养， 每天光照12 h， 光照强度为1 200 lx， 温度为21 ℃。
1.3.5 多倍体的鉴定 取诱导后的川贝母愈伤组织适量于2 g/L秋水仙素溶液中预处理2.5 h左右，水洗后用甲醇-冰醋酸（体积比3∶1）固定液固定4 h，再用混合酶（纤维素酶和果胶酶各占25 g/L）在25 ℃恒温箱内处理3 h，倒去酶液，用去离子水洗3次，每次2 min，除去去离子水后制备细胞悬液，用悬滴法[6]制片，干燥后，用Giemsa染色后观察。
1.3.6 总生物碱含量的测定 参照参考文献[7]里川贝母项下方法，取西贝母碱5 mg，精密称定，置于25 mL容量瓶中，加入三氯甲烷至刻度，摇匀，备用。精密量取对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、1.0 mL置于25 mL具塞试管中，分别补加三氯甲烷至10.0 mL，精密加水5 mL，再精密加0.5 g/L溴甲酚绿缓冲液2 mL，密塞，剧烈振摇，转移到分液漏斗中，放置30 min，取三氯甲烷液，用干燥滤纸滤过，取续滤液，以相应的试剂为空白对照，参照紫外-可见分光光度法在415 nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，西贝母碱浓度为横坐标，绘制标准曲线。
本试验采用紫外分光光度法测定其总生物碱含量。精密称取烘干至恒重的野生川贝母鳞茎、二倍体组培愈伤组织、多倍体愈伤组织样品各2.0 g，置于具塞锥形瓶中，加浓氨水3 mL，浸润1 h，加三氯甲烷-甲醇（体积比4∶1）混合液40 mL，置于80 ℃水浴加热回流2 h，放冷过滤，滤液置于50 mL量瓶中，用适量三氯甲烷-甲醇（体积比4∶1）混合液洗涤药渣2～3次，洗液并入同一量瓶中，加三氯甲烷-甲醇（体积比4∶1）混合液至刻度，摇匀。精密量取2～5 mL，置于25 mL具塞试管中，水浴蒸干，精密加入三氯甲烷10 mL使其溶解，精密加水5 mL，再精密加0.5 g/L溴甲酚绿缓冲液2 mL，密塞，剧烈振摇，转移到分液漏斗中，放置30 min，取三氯甲烷液，用干燥滤纸过滤，取续滤液，待用。以相应的试剂为空白对照，参照紫外-可见分光光度法，在415 nm的波长处测定吸光度，用回归方程[8]计算其总生物碱的含量。总生物碱含量=（A+0.012）×n/（W×106×0.010 8）×100%，式中，A――吸光度;n――稀释倍数;W――试样质量。
2 结果与分析
2.1 愈伤组织的获得
将川贝母无菌鳞茎小块置于愈伤组织诱导培养基MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.3 mg/L+蔗糖30 g/L中培养20 d左右，鳞茎切口处出现淡绿色愈伤组织，随着培养时间的延长，愈伤组织的颜色逐渐加深，继续继代培养30 d，即可获得大量的川贝母愈伤组织。
2.2 正交试验结果
2.2.1 直观分析结果 根据正交试验L9（34）进行试验，30 d左右对其进行数据统计。以多倍体诱导率为评价指标，然后对试验结果进行极差和方差分析，并确定其最优组合。
为了直观起见，以因素为横坐标，诱导率为纵坐标，作效应曲线（图1）。由表2可知，各因素对多倍体诱导率的影响次序为：秋水仙素浓度>浸泡时间>二甲基亚砜体积分数>处理温度， 秋水仙素浓度为主要因素，处理温度为次要因素， 最优组合是A2B3C3D3，即秋水仙素浓度为900 mg/L， 浸泡时间为48 h，添加的二甲基亚砜体积分数为4%， 处理温度为25 ℃。由图1可知，秋水仙素浓度在600～900 mg/L范围内， 多倍体诱导率随着秋水仙素浓度的增加而升高。这与王强等[4]在秋水仙素诱导川贝母愈伤组织多倍体研究中的结论相符。秋水仙素浓度在900～1 200 mg/L范围内， 多倍体诱导率随着秋水仙素浓度的增加反而有所降低， 因为高浓度的秋水仙素对细胞的伤害作用增大， 愈伤组织的受害率增加，进而影响其诱导率。
2.2.2 方差分析结果 直观分析法不能估计试验误差大小，也不知道分析的精度[9]，因此需采用方差分析法进行统计学检验。
由方差分析可知，本试验中的秋水仙素浓度、浸泡时间、二甲基亚砜体积分数都对多倍体的诱导率影响显著，而处理温度对多倍体的诱导率影响不显著。根据直观分析结果，综合考虑确定川贝母的最适培养温度为20～21 ℃，其最优组合为A2B3C3D2，即秋水仙素浓度为900 mg/L，浸泡时间为48 h，添加的二甲基亚砜体积分数为4%，处理温度为20 ℃。
2.2.3 验证试验结果 由于本试验的最优组合未在试验组中出现，因此需进行验证试验。按照最佳工艺条件A2B3C3D2对川贝母愈伤组织进行多倍体诱导，结果多倍体诱导率为94.3%，诱导率较高，优选的工艺条件稳定可行，重现性好。因此本试验的最优组合为A2B3C3D2，即秋水仙素浓度为900 mg/L，浸泡时间为48 h，二甲基亚砜体积分数为4%，处理温度为20 ℃。
2.3 多倍体鉴定结果
取诱导后的川贝母愈伤组织进行染色体数目检测，并进行显微拍照，结果见图2和图3。对照组的染色体数2n=24，诱导组的染色体数2n=48，由此可以确定诱导后的川贝母愈伤组织为多倍体。
2.4 含量测定结果
按照参考文献[7]川贝母项下进行，在415 nm处测吸光度，以吸光度为纵坐标、取样量为横坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程为Y=10.663X-0.001 0，r=0.999 8，结果显示取样量在0.004 88～0.035 04 mg有良好的线性关系。
测定各样品的吸光度并计算其生物碱总含量（表3）。试验结果显示野生川贝母鳞茎生物碱总含量为0.237%，组培二倍体愈伤组织生物碱总含量为0.249%，经最佳处理培育的组培多倍体愈伤组织生物碱总含量为0.657%。
2.5 生物碱总含量的比较结果
由表4可知，组培多倍体愈伤组织生物碱总含量较组培二倍体愈伤组织、野生川贝母鳞茎均高，几乎是后二者的3倍。分析原因可能是组培多倍化后的川贝母随着其染色体加倍，细胞内有效成分也随着加倍。且经组培的川贝母在人为管理下，其生长环境更有利于细胞内有效成分的积累，所以结果中显示出组培二倍体愈伤组织生物碱总含量大于野生川贝母鳞茎。因此，采用多倍体诱导技术可以快速使有效成分生物碱的含量增加。这不仅可以改善长期以来采挖野生川贝母为药用资源的现状，而且对野生川贝母资源的保护起到了积极作用。
3 讨论
近年来在许多药用植物诱导获得多倍体的研究中，多采用秋水仙素对试验材料进行处理，诱导率普遍为30%左右[10]。本试验通过正交设计，考察了包括秋水仙素浓度、浸泡时间、二甲基亚砜体积分数、处理温度对川贝母愈伤组织多倍体诱导率的影响。结果表明，当秋水仙素浓度为900 mg/L、浸泡时间为48 h、二甲基亚砜体积分数为4%、处理温度为20 ℃时，多倍体诱导率最佳。
试验表明，当二甲基亚砜体积分数为0～4%时，多倍体的诱导率一直增高，而且与相关研究的多倍体诱导率比较，本试验川贝母多倍体诱导率有所提高。如王强等[4]在秋水仙素诱导川贝母愈伤组织多倍体的研究中，诱导率最高为70%，而本试验诱导率高达94.3%。分析其原因为二甲基亚砜是一种渗透剂，它能提高细胞壁的透性[11]，从而有利于秋水仙素进入植物细胞，这就增大了秋水仙素分子与微管蛋白二聚体结合的机会，从而使微管蛋白的形成受阻，进而抑制或妨碍细胞的纺锤丝形成，使分裂的染色体停留在赤道板，不向两级移动，导致染色体数目增加。由此可见，本试验浓度范围内的二甲基亚砜对川贝母愈伤组织多倍体的诱导率具有增效作用。
为确定多倍化川贝母对生物碱含量的影响，本试验将经多倍化诱导的川贝母与组培二倍体愈伤组织以及野生川贝母鳞茎进行了生物碱总含量测定。结果表明，组培多倍化后的川贝母生物碱总含量最高。目前，已知生物碱是贝母属植物的药用有效成分，甾类生物碱又是其主要类型[12]。大多数的植物通过甲戊羟酸途径合成甾类化合物，川贝母甾类生物碱的合成也被认为是主要通过此途径完成[13，14]。在合成的途径中，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）是一种比较重要的酶。随着对HMGR研究的深入，越来越多的研究结果表明，一些生物或非生物刺激可以调节HMGR的转录或表达水平，从而对下游甾类化合物的生物合成进行人为调控[15，16]。本试验所采用的4种因素对川贝母进行的多倍体诱导是否间接影响了生物碱的合成还有待进一步研究。
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