苯海拉明软膏微生物限度检查方法的验证

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【摘要】 目的 建立苯海拉明软膏微生物限度检查方法。 方法 采用常规法进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证和控制菌检查的验证。 结果 采用常规法， 细菌、霉菌及酵母菌的回收率均>70%， 并可检出铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。 结论 经方法学验证， 结果符合现行《中国药典》2010年版的要求。

【关键词】 苯海拉明软膏；微生物限度；验证

【Abstract】 Objective To establish a method to test microbial limit in diphenhydramine ointment. Methods Conventional method was adopted to verify bacteria， mold and yeast count method and control bacteria check. Results By conventional method， all of the recoveries of bacteria， mold and yeast were above 70%， pseudomonas aeruginosa and staphylococcus aureus were detected. Conclusion Through the technological validation， the result is consistent with the requirement of “Chinese Pharmacopoeia”（edition 2010） in force.

【Key words】 Diphenhydramine ointment； Microbial limit； Validation

苯海拉明软膏为中山大学孙逸仙纪念医院的外用制剂， 其主要成分为盐酸苯海拉明和黄凡士林， 具有抗过敏、止痒、消炎、消肿作用。2013年广东省食品药品监督管理局对医院制剂提出了标准提高的要求。现根据《中国药典》2010年版[1]， 对苯海拉明软膏微生物限度检查方法进行验证， 以保证测定结果的可靠性。

1 仪器与材料

1. 1 仪器 HTY-2000B集菌仪（杭州泰林医疗器械厂）、NS01-75D1薄膜过滤器（北京牛牛基因技术有限公司， 批号20121223）、超净工作台（苏净集团安泰公司）、303A-1生化培养箱（上海浦东荣丰科学仪器有限公司）、SPX-100B生化培养箱（上海悦丰仪器表有限公司）。

1. 2 试药 营养琼脂培养基（批号：121220）， 玫瑰红钠琼脂培养基（批号：130108）， 营养肉汤培养基（批号：121214）， 改良马丁培养基（批号：130109）， 改良马丁琼脂培养基（批号：130109）， 胆盐乳糖培养基（批号：120309）， 溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基（批号：130215）， 甘露醇氯化钠琼脂培养基（批号：130520）（以上均来源于北京三药科技开发公司）。苯海拉明软膏（中山大学孙逸仙纪念医院， 批号：201309118， 201301111， 201401118；规格：30 g）。

1. 3 菌种 大肠埃希菌（Escherichia coli） [CMCC（B）44 102]， 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26 003]， 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） [CMCC（B）63 501]， 白色念珠菌（Candida albicans） [CMCC（F）98 001]， 黑曲霉（Aspergillus niger） [CMCC（F）98 003]， 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10 104]（以上菌种的冻干菌均购自中国食品药品生物检定研究院）。

2 方法与结果

2. 1 菌液制备

2. 1. 1 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌 取新鲜培养物接种至营养肉汤培养基中， 置30～35℃培养18～24 h；培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成含菌数为50～l00 cfu/ml的菌悬液。

2. 1. 2 白色念珠菌 取新鲜培养物接种至改良马丁培养基中， 置23～28℃培养24～48 h；培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成含菌数为50～100 cfu/ml的菌悬液。

2. 1. 3 黑曲霉 取新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基中， 置23～28℃培养5～7 d， 加入3～5 ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液， 将孢子洗脱。然后， 采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内， 用含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成含孢子数50～100 cfu/ml的孢子悬液。

2. 2 供试液制备 取供试品10 g、十四烷酸异丙酯20 ml至含无菌玻璃珠的锥形瓶中， 置45℃水浴中， 充分振摇， 使供试品溶解， 再加入45℃ pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 ml， 振摇5～10 min， 置45℃水浴保温、静置使分层， 取下层作为1：10的供试液。

2. 3 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证

2. 3. 1 试验组 各取1：10供试液、试验菌液1 ml， 注入同一平皿中， 立即倾注相应琼脂培养基， 待凝结后， 培养， 每株试验菌平行制备2个平皿， 测定试验组的平均菌落数。

2. 3. 2 菌液组 取试验菌液1 ml， 注入平皿中， 立即倾注相应琼脂培养基， 待凝结后， 培养， 每株试验菌平行制备2个平皿， 测定菌液组的平均菌落数。

2. 3. 3 供试品对照组 各取1：10供试液1 ml， 注入平皿中， 立即倾注相应琼脂培养基， 待凝结后， 培养， 测定供试品对照组的平均菌落数。

2. 3. 4 回收率计算 各菌株回收率（%）=（试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数）/菌液组的平均菌落数×100%。结果见表1（回收率应不低于70%）。

由表1可知， 用1 ml/皿供试液时， 各菌株的回收率均可达到70%以上， 且3次均能重现试验结果， 因此本品的细菌、霉菌及酵母菌计数可用平皿法检查（即1 ml/皿）。

2. 4 控制菌检查方法的验证 本品为局部给药制剂， 根据《中国药典》2010年版， 控制菌应检铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。

2. 4. 1 铜绿假单胞菌检查法的验证 分别取1：10供试液10 ml、铜绿假单胞菌菌悬液1 ml， 加至胆盐乳糖培养基100 ml中， 按铜绿假单胞菌检查法进行验证。结果见表2。

2. 4. 2 金黄色葡萄球菌检查法的验证 分别取1：10供试液10 ml、金黄色葡萄球菌菌悬液1 ml， 加至营养肉汤培养基100 ml中， 按金黄色葡萄球菌检查法进行验证。结果见表2。

由表2可见， 本品可用常规法检查铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。

3 讨论

同一人工污染菌种及接种量的微生物在不同剂型药品里可有不同的检出结果， 一些非水溶性油剂或软膏剂， 可因其与水难溶， 其中污染的微生物难与培养基成分接触或因缺氧而可能不生长[2]。因此正确地制备供试液， 使药品中污染的微生物得以真实反映， 是保证检验结果正确可靠的重要前提。

以此次验证试验结果为依据， 确定可采用常规法测定苯海拉明软膏的细菌、霉菌、酵母菌数和控制菌铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌的检查。

参考文献

[1] 国家药典委员会.中国药典（二部）.北京：中国医药科技出版社， 2010.

[2] 马绪荣， 苏德模.药品微生物学检验手册.北京：科学出版社， 2001：56.

[收稿日期：2014-04-28]