Hedgehog信号通路在尖锐湿疣皮损患者中的影响研究

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【摘要】目的：探讨hedgehog信号通路三个关键蛋白Patched-1、Gli-1以及Smo在尖锐湿疣患者发病中的作用。方法：本组共收集56例尖锐湿疣患者、40例尖锐湿疣治疗患者以及20例正常人，应用ELISA、Western以及RT-PCR法检测尖锐湿疣皮损患者、咪喹莫特治疗一个疗程后观测患者及正常人皮肤中Patched-1、Gli-1以及Smo的蛋白及mRNA的表达特点。结果：三组Patched-1、Gli-1以及Smo三个指标ELISA以及Western蛋白、RT-PCR mRNA表达，患者组均明显高于对照组（P

【关键词】尖锐湿疣；咪喹莫特乳膏；Patched-1；Gli-1；Smo

【Abstract】Objectives： To investigate the influence of three proteins， Patched-1， Gli-1 and Smo， in the Hedgehog signaling pathway on genital warts patients with lesions. Methods： ELISA， Western and RT-PCR were used to detect Patched-1， Gli-1 and Smo proteins and the expression of mRNA of genital warts patients with the lesions treated with imiquimod. The result was compared with that of normal people. Results： There were 56 cases of genital warts untreated patients， 40 cases of genital warts in treatment group and 20 cases in the control group. The level of three key proteins， Patched-1， Gli-1 and Smo of the patient group were significantly higher than these of the normal group as well as the expression of mRNA （P

【Key words】Genital warts； Imiquimod cream； Patched-1； Gli-1； Smo

【中图分类号】R 7525【文献标志码】A

尖锐湿疣（condyloma acuminata，CA）是临床中最为常见的性病之一，近年来随着人们交流的日益增加及一些众所周知的原因，其在性病科的发生率逐年增高，已经成为仅次于淋病的性病之一[1]。本病是由人类瘤病毒（Papilloma Virus，HPV）引起，发生后治疗方法较多，但总有部分患者复发[2]。目前，临床中还没有一种单一的治疗方法根除HPV，这可能与HPV进入人体皮肤后发病机理没有完全明确有关[3]。近年来关于Hedgehog信号通路的研究越来越多，但其与CA的关系目前在报道较少，本次作者着眼于此，探讨分析Hedgehog信号通路在CA中的作用，以为研究本病的感染机理提供一定的参考。

1资料与方法

11病例入选标准

本组收集尖锐湿疣治疗患者均来源于我院皮肤科门诊2013年2月至2014年4月收治的患者，所有患者均诊断为典型CA病患，共96例，男58例，女38例，中位年龄296岁，病程4d～4个月，平均（264±103）d；其中56例为首次确诊为尖锐湿疣患者，取材前未接受相关药物治疗，另40例尖锐湿疣患者为确诊且接受为期1疗程的治疗，分别记为未治疗组（56例）和治疗组（40例）。抽取同期于我院体检健康者20例为对照组（男女各10例，中位年龄287岁），行皮肤液的提取均经本人同意，并签署知情同意书。

排除标准：排除同时合并心、肝、肾等严重脏器器质性病变患者，排除合并高血压、高血脂、糖尿病、甲状腺疾病等相关内分泌疾病患者，排除贫血、白细胞异常减少或存在其他自身免疫性疾病患者，排除复发性尖锐湿疹患者。

未治疗组纳入标准：确诊前未接受其他药物治疗；未合并银屑病、淋病、梅毒等其他皮肤性疾病。

治疗组纳入标准：为首次尖锐湿疣确诊患者，且刚完成为期1疗程抗病毒治疗，治疗过程中均依医嘱按时服药；未合并银屑病、淋病、梅毒等其他皮肤性疾病。

12标本采集方法

患者皮肤组织液的采集时间为早上8点到10点，收集皮肤提取液1mL，收集后立即置于零下80℃超低温冰箱保存，待统一做实验时取出用。

13试剂盒与抗体

人GLI家族锌指蛋白1（GLI1）ELISA试剂盒购于上海信裕生物科技有限公司（生产批号：11814273001，规格96T）、Patched/PTCH检测ELISA试剂盒购于德国QIAGEN试剂盒（产品编号：301305，SuperFect Transfection Reagent ，规格12ml）、Smoothened蛋白（SMO）检测试剂盒购于上海酶联生物科技有限公司（货号：EIA-14657 ，规格：96Wells）；ECL发光试剂盒（货号：WB043，规格：100mL）、多克隆抗体Patched-1、Gli-1以及Smo以及单克隆抗体β-actin购于Santa Cruz公司，二抗购于武汉博士德生物工程有限公司，总RNA提取试剂盒购自SunShineBio公司（货号：R-4875，规格：50次），引物购于生工生物（上海）股份有限公司。

14相关指标检测方法

Patched-1、Gli-1以及Smo的测定方法为Elisa法，同时Western Blot以及RT-PCR进一步确认。

15Western Blot检测

取05mL表皮提取液，5000r/min离心提取上清液，BCA定量蛋白，取各样本80μg行聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳，取电泳后目标蛋白半干转法移至PVDF膜，加牛奶封闭2h后取出，加相应一抗洗涤3次，之后加相应二抗洗涤3次，暗室内曝光洗片，扫描仪扫描胶片图像、Image J计算各灰度值，β-actin作内参对照。

16RT-PCR检测

取样本总RNA提取试剂盒提取总RNA，定量，定量后每取2μg逆转录cDNA；逆转出cDNA立即行PCR扩增目的片段，扩增次数为35次；扩增出DN段后电泳，电泳完成后用凝胶成像仪拍照，Image J软件计算荧光强度值，β-actin作内参对照。

17统计学处理

所有数据处理均用SPSS190统计学软件软件，计量资料以均值±标准差（±s） 表示，各组间比较采用t检验，以P

2结果

21治疗后Elisa

Patched-1、Gli-1以及Smo治疗组三个蛋白Elisa检测结果其表达均明显高于对照组（P

22Western Blot结果比较

由图1可以明显看出，Patched-1、Gli-1以及Smo患者组三个蛋白表达均明显高于对照组（P

3讨论

CA具有极强的传染性，一旦发生会给患者带来严重的身心压力，本病传染方式有传播和接触感染患者生活物品两种，其中传播为绝大多数感染方式[4]。在20世纪60、70年代，CA在我国几乎很少见到，但是随着改革开放的进行，特别是20世纪90年代以来，CA开始逐渐流行起来，这些患者绝大多数均有性乱史，且不少患者往往合并梅毒等其它性传播疾病。毫不夸张的说，是性乱加速了本病的传播，本病可发生于任何一个年龄段，其中临床中以20～40岁青中年患者多见[5，6]。本病在临床中病理形态主要有以下几个特点：（1）患者生殖器官及周围上皮中表层有一些凹空细胞[7]；（2）患者相关组织细胞上有过量的角化或角化不全；（3）患者相关器官部位有一些棘细胞及一些基底细胞增生；（4）患者表皮出现一些尖头状、扁平状、状、内生型以及非典型小块并有向周围扩展的特点[8]。

有研究认为，本病病毒侵入人体并不立即发病，而是有一定的潜伏期，在潜伏期内，HPV侵入表皮细胞，借助于体内的DNA复制系统，完成自我复制同时侵染临近细胞，最终病毒的量达到一定的程度时，则会造成本病发病[9]。但近几年的研究也表明[10，11]，HPV除了具有自我复制的能力外，也可以抑制抗复制基因的表达，Hedgehog基因是近年来研究较多的一种抑癌基因，但是关于其与CA的研究目前国内外研究较少，Hedgehog基因主要编码Hh蛋白，编码后的Hh蛋白发挥作用需要两种受体基因Patched（Ptc）和Smoothened（Smo）的激活[12，13]。受体Ptc由肿瘤抑制基因Patched编码，其蛋白由12个跨细胞膜的肽链构成，能与Hh蛋白直接结合，对Hh蛋白起负调控作用。Smo蛋白是Hh蛋白直接传递所需要的一种受体，其也是一种跨细胞膜蛋白，由7个跨膜区组成，在病毒没有感染的情况下，Ptc抑制Smo蛋白活性，进而抑制了下游的蛋白表达[14]。Gli蛋白受Ptc与Smo蛋白的共同作用，上述两个蛋白抑制下游蛋白的活性是通过Gli蛋白直接作用的，三个蛋白共同构成了Hedgehog信号通路的一环[15]。本文研究结果显示：Patched-1、Gli-1以及Smo三个指标Elisa以及Western蛋白、RT-PCR mRNA表达，患者组均明显高于对照组（P

综合提示尖锐湿疣皮损表皮中Patched-l、Gli-1以及Smo均处于高表达状态，治疗后可明显降低其活性，今后上述三个指标或许可用为检测药物治疗后评价指标。

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（收稿日期：2014-08-29）