四环素耐药基因在猪粪便、堆肥和土壤中的归趋

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摘 要：抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes，简写为ARGs）是一种新兴的环境污染物[1]，在我国禽畜养殖业中由于抗生素的大量使用，导致禽畜粪便中ARGs广泛存在，但其在环境中归趋的研究还较少。四环素是我国禽畜养殖业中广泛使用的抗生素，本研究采用分子生物学技术，研究了猪粪便中四环素耐药基因（antibiotic resistance genes，TRGs）的分布以及迁移变化。通过普通PCR定性检测，发现在养猪场各样品中均检测出TRGs。荧光定量PCR检测发现猪粪堆肥中tet（A）和tet（C）基因的含量相比于土壤中的tet（A）和tet（C）的含量均高0～1个数量级，而比新鲜猪粪中的分别低0～3和1～4个数量级。据此推测TRGs在新鲜猪粪、堆肥和土壤中总体呈逐级降低的趋势，堆肥处理有利于TRGs含量的消减。

关键词：四环素耐药基因；猪粪便；堆肥；土壤；PCR；定量PCR

中图分类号 X713；X53 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）09-0022-03

Abstract：Antibiotic resistance genes（ARGs）is an emerging environmental pollutants，a large amount of tetracycline in livestock breeding in China，but the migration and fate of drug resistence genes in the environment is still far more enough. This study by using modern molecular biological technology，tetracycline resistance genes（TRGs）in pig manure was studied distribution and migration of change. Through ordinary PCR detection，find TRGs were detected in all samples of pig farms. qPCR detection results showed thatthe tet（A）and tet（C）in pig manure compost are lower 0～3，1～4 logs than in fresh pig manure ，the tet（A）and tet（C）in the soil are lower 0～1 logs than pig manure composting. Presumably TRGs in manure，compost and soil is gradually decreasing trend，composting may be good for decreasing of TRGs.

Key words：TRGs；Pig manure；Compost；Soil；PCR and qPCR

1 前言

由于禽畜B殖中大量抗生素的滥用致使粪便中的ARGs不断增加，当这些粪便作为有机肥施用到土壤中是否会将ARGs传播到土壤环境中，加重土壤环境的污染负荷，进而危害人类健康，这是一个急需解决的问题。因此，本研究以TRGs为代表，对猪粪便、堆肥和土壤中TRGs进行分子生物学研究，探究TRGs随着猪粪便在环境中的迁移归趋，为环境中TRGs的相关研究提供参考依据。

2 材料与方法

2.1 样品采集 本研究的采样地点是在上海市松江区某大型养猪场。

采样时间分别为2015年3月22日，6月28日，9月18日和12月6日，分别记为3月、6月、9月和12月，每次将样品采集后放入冰盒中运回实验室，立即放入-80 ℃冰箱内低温保存。

每次采集的样品分为四组，分别为幼猪粪、成猪粪、猪粪堆肥和土壤。其中体重小于75kg的猪粪便作为幼猪粪；体重超过75kg的粪便作为成猪粪；新鲜猪粪发酵1～2个月的作为猪堆肥；长期施用该养猪场内猪粪的农田土壤为土壤。

2.2 DNA的提取 本研究粪便、堆肥和土壤样品中总DNA提取采用DNA快速提取试剂盒（Fast DNA kit for soil，MP），具体提取方法参见本课题组先前研究[2]。

2.3 PCR反应 以DNA快速提取试剂盒提取的各样品的总DNA作为模板，进行普通PCR定性检测，检测TRGs基因是否在各样品中总DNA中含有，本研究共选取10种TRGs基因，分别为tet（A）、tet（B）、tet（C）、tet（D）、tet（E）、tet（G）、tet（M）、tet（O）、tet（S）、tet（X）。具体的定性PCR检测操作步骤详见参考文献[2]。

2.4 凝胶电泳实验 利用溴化乙锭染色浓度为1%的琼脂糖凝胶进行电泳验证PCR扩增产物是否含有目的基因。吸取5μL PCR扩增产物与1μL Loading Buffer混合均匀，点入已做好的琼脂糖凝胶中，用DL2000 DNA Marer作标尺，然后于140V电压下，用电泳仪运行25min左右，用紫外凝胶成像系统观察条带结果。

2.5 荧光定量PCR 本研究选取了2种具有代表性的四环素抗性基因（tet（A）和tet（C））进行定量检测。20μL的定量PCR反应体系中包含10μL的SYBR，各0.4μL浓度为10μmol/L的上下游引物，2μL的DNA模板，7.2μL的灭过菌的超纯水，将各试剂加入到PCR小管中[1]，将小管放入Roche实时荧光定量PCR仪上运行，运行程序为：95℃预变性600s，35个循环包括95℃变性10s，退火10s（退火温度详见文献[2]），72℃延伸15s，用超纯水代替样品进行阴性对照，每个样品均做2次重复。

3 实验结果与分析

3.1 普通PCR定性检测 通过PCR定性检测发现，猪粪、堆肥和土壤中普遍存在TRGs基因。有研究发现在所有ARGs种类中TRGs检出率较高，而且TRGs基因在养殖场的废水、土壤及其周围地下水中检出率为100%[3]。本研究所检测的所有季节样品中10种TRGs基因均被检测到。tet（A）、tet（B）、tet（C）、tet（D）、tet（E）、tet（G）、tet（M）、tet（O）、tet（S）、tet（X）的检出率分别为1、8/16、1、3/16、7/16、12/16、13/16、12/16、14/16、14/16。其检出率大小顺序为tet（A）、tet（C）>tet（S）、tet（X）>tet（M）>tet（G）、tet（O）>tet（B）>tet（E）>tet（D）。其中tet（A）、tet（C）的检出率最高，且在所有样品中均检测到，tet（E）的检出率为7/16。张俊[4]等研究沭阳市某养猪场周边耕地土壤中四环素抗性基因tetA、tetC、tetE均检测到，且丰度较高。郭怡雯[5]在研究污水处理厂中四环素耐药基因中发现tet（E）的检出率为3/8，与本实验的结果较为接近，但是Zhang等[6]研究活性污泥中四环素耐药基因，活性污泥中的tet（E）基因的检出率为11/15，检出率较高。本研究中tet（D）的检出率最低，仅为3/16。同课题组的严剑芳等[2]先前研究结果表明tet（D）的检出率也较低，只有1/14。Zhang等[6]研究活性污泥中四h素耐药基因，结果活性污泥中tet（D）的检出率为2/15；郭怡雯[5]研究污水处理厂中四环素耐药基因发现tet（D）的检出率为1/8；先前研究发现tet（D）在环境样品中的检出率较低，这与本研究结果基本一致。剩余的6种TRGs基因的检出率范围为8/16～14/16。严剑芳[2]研究发现这些TRGs基因的检出率范围为12/14～14/14；Zhang等[6]的研究表明这些TRGs基因的检出率范围为14/15～15/15。研究表明环境中是普遍存在这些TRGs基因。

本研究中的TRGs基因在不同环境样品中的检出率存在差异，检出率从小到大依次为土壤

3.2 荧光定量PCR检测

3.2.1 养猪场各样品中tet（A）的含量 由表1知，所有样品中新鲜猪粪中tet（A）的含量均比猪粪堆肥和土壤中的高0～3个数量级，猪粪堆肥中tet（A）的含量除3月外均高于土壤，这说明堆肥对tet（A）可能有一定的消减作用，也说明土壤中微生物体内含有可能通过基因水平转移的耐药基因。有研究[7]发现在经常施用猪粪的土壤中的TRGs中发现耐药性的质粒。分析表明耐药基因的迁移转化是通过水平转移实现的。

如图1所示，3月和12月的不同样品中tet（A）的含量整体变化趋势大致相同，6月和9月的不同样品中tet（A）的含量整体变化趋势相同，其中6月、9月和12月与3月的不同之处在于猪粪堆肥中tet（A）的含量略微高于土壤中。

经分析可知，新鲜猪粪中tet（A）的含量普遍高于猪粪堆肥和土壤，其可能原因是堆肥能有效降解粪便中的四环素类抗生素以及杀死携带抗性基因的微生物，耐药基因进一步消除使其含量降低。王等[8]研究了堆肥处理对猪粪便中TRGs含量变化，结果表明猪粪中TRGs含量经过堆肥处理后显著降低。韦蓓[9]研究了活性污泥堆肥处理对TRGs的影响，结果表明堆肥可以降解多种抗生素，包括中四环素、土霉素和金霉素。研究表明堆肥可能对tet（A）有一定的消减作用。

3.2.2 养猪场各样品中tet（C）的含量 由表2可以看出，新鲜猪粪中的tet（C）含量在各季度中均比猪粪堆肥和土壤中的高0～3个数量级。猪粪堆肥中tet（C）含量除3月外均大于土壤中的。6月和9月幼猪粪小于成猪粪，而3月和12月则是成猪粪小于幼猪粪。其原因可能与气温、饲料等环境因素有关，具体原因还需进一步研究。

如图2所示，3月幼猪粪样品中tet（C）含量最高，猪粪堆肥最低；6月成猪粪样品中tet（C）的含量最高，土壤最低，这与9月的检测结果一致，但是9月猪粪堆肥样品中tet（C）的含量高于幼猪粪，这与6月的不同；12月各样品中tet（C）的含量最高为幼猪粪，最低为土壤。不同月的各样品中tet（C）的含量变化整体呈下降趋势，这与tet（A）的变化趋势大概一致。

4 结论

（1）不同季节采集的养猪场所有样品中TRGs基因的检出率由大到小的顺序依次为成猪粪>幼猪粪>猪粪堆肥>土壤。

（2）本研究对猪粪、猪粪堆肥和土壤样品中tet（A）和tet（C）基因含量进行实时荧光定量PCR方法检测，结果表明新鲜猪粪中的tet（A）和tet（C）基因的含量在各季度中均比猪粪堆肥和土壤中的高0～4个数量级，而猪粪堆肥中tet（A）和tet（C）基因的含量比土壤中的低0～1个数量级。研究结果表明，TRGs基因在猪粪、堆肥和土壤中的含量呈逐级降低的趋势，新鲜猪粪经过堆肥处理可能对TRGs具有消减作用。

参考文献

[1]Pruden A，Pei R，Storteboom H，et al.Antibiotic resistance genes as emerging contaminants：Studies in northern Colorado[J].ENVIRONMENTAL SCIENCE & TECHNOLOGY，2006，40（23）：7445-7450.

[2]严剑芳.四环素耐药菌和耐药基因在禽畜粪便、堆肥和土壤中的分布[D].上海：华东师范大学，2015.

[3]Zhang X，Zhang T，Fang H H P.Antibiotic resistance genes in water environment[J].APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY，2009，82（3）：397-414.

[4]Zhang J，Yang X，Ge F，et al. Effects of Long-Term Application of Pig Manure Containing Residual Tetracycline on the Formation of Drug-Resistant Bacteria and Resistance Genes[J].Huanjing Kexue，2014，35（6）：2374-2380.

[5]郭怡雯.污水理厂活性污泥中四环素耐药基因和耐四环素乳糖发酵型肠杆菌研究[D].上海：华东师范大学，2009.

[6]Zhang T，Zhang M，Zhang X，et al. Tetracycline Resistance Genes and Tetracycline Resistant Lactose-Fermenting Enterobacteriaceae in Activated Sludge of Sewage Treatment Plants[J].ENVIRONMENTAL SCIENCE & TECHNOLOGY，2009，43（10）：3455-3460.

[7]Knapp C W，Dolfing J，Ehlert P A I，et al.Evidence of Increasing Antibiotic Resistance Gene Abundances in Archived Soils since 1940[J].ENVIRONMENTAL SCIENCE & TECHNOLOGY，2010，44（2）：580-587.

[8]Wang L，Oda Y，Grewal S，et al.Persistence of Resistance to Erythromycin and Tetracycline in Swine Manure During Simulated Composting and Lagoon Treatments[J].MICROBIAL ECOLOGY，2012，63（1）：32-40.

[9]韦蓓，黄福义，苏建强.堆肥对污泥中四环素类抗生素及抗性基因的影响[J].环境工程学报，2014（12）：5431-5438.

（责编：张长青）