双偏振极化干涉技术实时研究三磷酸腺苷与其适配体相互作用

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摘要 利用双偏振极化干涉（Dual polarization interferometry，DPI）测量技术实时研究了三磷酸腺苷（AP）与其适配体（APbinding aptamer， ABA）间的相互作用。将单链ABA固定在DPI氮化硅芯片上，采用DPI技术实时监测AP与固定的ABA的相互作用过程中敏感层的质量、厚度、密度的变化。通过详细分析敏感层质量变化，得到AP与ABA间的结合速率常数 （ka=466 × 103 L/（mol・s）、解离速率常数（kd =170 × 10 ymbolm@@ 2・s ymbolm@@ 1）、结合常数 （KA=27 × 105 L/mol）和解离常数（KD =37 × 10 ymbolm@@ 6 mol/L）。通过测定敏感层质量、厚度和密度随AP浓度的变化，分别建立了测定AP的方法，检出限（LOD， 3σ）分别为022 μmol/L（质量变化）、014 μmol/L（厚度变化）、032 μmol/L（密度变化）。本研究利用DPI技g揭示了ABA与AP相互作用中结构变化的实时信息，构建了新型AP传感器，用于实际血清样品中AP的检测，结果令人满意。

关键词 双偏振极化干涉； 核酸适配体； 三磷酸腺苷； 相互作用

1引 言

核酸适配体是通过指数富集配体系统进化（ELEX）技术，从随机单链寡聚核苷酸文库中筛选出的DNA或RNA寡聚核苷酸＼[1＼]。核酸适配体对相关配体具有高特异性和高亲和性，与抗体相比，适配体具有免疫原性低、靶分子范围广、价格低廉、可快速体外合成以及容易修饰等优点。因此，基于核酸适配体构建的生物传感器在蛋白质研究＼[2＼]、药物检测＼[3＼]、临床诊断＼[4＼]等方面得到了广泛应用。研究核酸适配体与靶分子间的相互作用过程，对于研究其相互作用机理，构建适配体传感器，具有重要的参考意义。高效液相色谱＼[5＼]、原子力显微镜＼[6＼]、电泳＼[7＼]、聚合酶链反应＼[8＼]、等温滴定量热法和荧光光谱技术＼[9，10＼]都被用来研究适配体和靶分子间的相互作用过程。尽管上述技术能够在天然状态下测定二者的相互作用信息，并且具有较高的选择性和灵敏度，但难以提供适配体与目标物结合过程中的实时动态参数信息。近年来，表面等离子体共振（urface plasmon resonance， PR）被广泛用于分析生物分子如蛋白质与蛋白质＼[11＼]、适配体与靶标＼[12＼]、蛋白质与金属离子＼[13＼]间等相互作用，可在线连续实时检测相互作用过程，提供实时的动力学信息。但是PR技术仅仅是通过折射系数的变化进行测量，主要反映结合过程中质量的变化，无法获得生物分子的构象变化等信息。

双偏振极化干涉（Dual polarization interferometry， DPI）测量技术是近年出现的一种新型表面分析方法。基于homas Young干涉原理，在传感片（感应波导片和参考波导片）表面发生分子相互作用或者吸附效应时，入射光经两个波导片，传播速率发生改变，导致由两个波导片射出的干涉条纹位置发生变化。根据麦克斯韦方程，通过测量相位的变化，可以获得精确的表面层厚度和折射率的变化＼[14＼]。DPI技术主要用于对表面分子间的相互作用过程进行实时监测和定量分析，无需标记，能够高精度地测量界面层厚度（001 nm）、质量（01 pg/mm2）和密度的变化＼[15＼]。DPI在DNA固定和杂交＼[16＼]、蛋白质相互作用过程中的构象变化＼[17＼]、DNA/蛋白质和小分子之间的相互作用＼[18＼]和生物标志物的检测＼[19＼]等界面化学、生物分子相互作用及定量检测等方面得到越来越多的应用，是研究分子间相互作用的有力工具。

三磷酸腺苷（AP）在细胞代谢的调节过程中发挥了重要的作用，为生物体中的各种生化反应，如DNA复制、生物合成、膜离子通道泵、激素和神经元活性的调节等提供能量＼[20＼]。异常的AP水平与心血管疾病、帕金森氏病和阿尔兹海默氏病密切相关＼[21＼]。深入了解AP与其相应适配体（ABA）＼[22＼]间的相互作用过程及准确测定AP，对于了解机体代谢过程、预防疾病至关重要。本研究利用DPI技术实时研究了AP和ABA之间相互作用过程，获得了AP和ABA结合过程中的实时作用参数，如层质量、层厚度、层密度的变化信息。通过DPI提供的动力学信息，更深入理解AP和ABA之间的相互作用，精确测定了APABA的结合速率和解离速率常数。目前，尚未有采用DPI技术研究APABA相互作用的文献报道。此外，本研究基于ABA和DPI间的相互作用，构建了一种DPI传感器，用于高灵敏检测AP。

2实验部分

21仪器与试剂

AnaLight Bio 200双偏振干涉测量仪、氨基修饰的氮化硅芯片（英国Farfield ensors公司）；J810圆二色谱仪（日本Jasco公司）。

三磷酸腺苷三钠（AP）、三磷酸鸟苷三钠（GP）、三磷酸尿苷三钠（UP）、三磷酸胸苷三钠（CP）、核酸适配体（cABA： biotin5′ACC G G AG A GCG GAG AA G3′；ABA： biotin 5′ACC GG GGG AG A GCG GAG GAA GG3′）、戊二醛、链霉亲和素（A，上海生工生物工程有限公司）。20 mmol/L risCl 缓冲溶液 （150 mmol/L NaCl， 3 mmol/L KCl， 5 mmol/L MgCl2）。实验用水为MilliQ超纯水（18 M

ymbolWA@ ・cm，美国Millipore公司）。

22圆二色光谱实验

圆二色光谱 （CD）在Jasco J810圆二色光谱仪 （日本 Jasco公司）上测定。向400

ymbolmA@ L含4 μmol/L ABA的risCl 缓冲溶液中加入15 μmol/L AP，混合并反应3 min后测量CD光谱。对照实验采用cABA代替ABA，以同样方法测定。光谱测量范围为210～350 nm，扫描速度为200 nm/min，测量温度为室温。

23ABA的固定

将氨基修饰的氮化硅芯片安装在DPI仪器上，使缓冲液以50

ymbolmA@ L/min的流速流过芯片表面。基线稳定后，分别注射已知折射率的80%（V/V）乙醇溶液和超纯水进行仪器校准。设定缓冲液的流速为20 ymbolmA@ L/min， 基线稳定后，加入200 ymbolmA@ L 2%（V/V）戊二醛溶液，10 min 后切换回缓冲溶液。待基线稳定后，注射200 μL 05 mg/mL A溶液，10 min 后切换回缓冲溶液。待基线稳定后，注射200 ymbolmA@ L 4 μmol/L ABA，10 min 后切换回缓冲溶液，测定DPI信号。

24DPI测定AP与固定的ABA的相互作用

在固定ABA的DPI芯片上，注射不同浓度的AP，流经芯片表面且保持5 min。每次注射完AP后，向传感片表面注射 20 μL 10 mol/L NaCl 溶液，使传感片表面得到再生。实验完成后，原始实验数据由 AnaLight Bio200 分析软件进行处理。由横电场（E）和横磁场（M）的数据解析可以得到界面层厚度（hickness）和折射率（Refractive index，RI）变化。折射率 RI与层密度成比例，根据方程（1）可计算得到层密度＼[23＼]：

其中， ρL 为层密度（g/cm3）； nL和nbuffer 分别为敏感层和缓冲液的折射率；dn/dc 是折射率增量（RI increments，cm3/g），取值 0175。界面层质量则由层厚度和密度计算，根据方程（2）可得单位面积质量：

其中， mL为单位面积质量（ng/mm2）； τL为层厚度（nm）。

3结果与讨论

31DPI时监测ABA的固定过程

AP适配体传感界面的构建过程如图1所示。首先将链霉亲和素修饰到戊二醛（GA）预处理过的芯片表面上（A的氨基与GA的醛基作用）。然后，通过生物素和链霉亲和素间的特异性结合将生物素修饰的AP适配体（Biotinlyted ABA）固定在芯片表面。构建完成的适配体传感界面不仅可以研究AP和ABA之间的实时相互作用过程，还可用于检测AP。

适配体传感界面修饰过程中，表面层质量、层厚度、层密度的实时变化情况如图2A所示，当GA流经芯片表面时，层厚度、层质量和层密度均迅速增加。GA注射结束，切换到缓冲溶液后，表面层质量和层厚度先呈下降趋势，一段时间后到达稳定水平。这是由于非特异性吸附的物质或者固定不牢固的GA被缓冲液冲洗掉所致。当A流经芯片表面时，层质量和层厚度在初始阶段迅速增加，说明A通过氨基与芯片表面醛基结合被固定在芯片表面；随后，层质量、层厚度和层密度缓慢变化至平衡，表明A在芯片表面的结合趋于稳定。停止注射A后，芯片表面层质量、层厚度缓慢减小，最终达到稳定，而层密度轻微增加，说明A在芯片表面的结合很牢固，只有小部分A流失。当BioABA流经芯片表面时，层厚度和层质量随时间呈线性方式增加，同时层密度线性减小。当切换回缓冲溶液后，层质量、层厚度及层密度均发生轻微变化，然后保持稳定状态，说明BioABA固定在芯片表面。此外，以密度（即单位质量负载量）分别对层厚度和层密度变化做图。GA、A、BioAP被引入到芯片表面层的实时变化过程如图2B和图2C所示。每个固定层的质量、厚度和密度详细参数示见表1（电子版文后支持信息）。根据表1，A的结合质量约为122 ng/mm2，相当于结合了约110×1010个/mm2分子，与文献＼[24＼]报道的结果相似；ABA的结合质量为022 ng/mm2，相当于在A表面上固定13×1010个/ mm2分子。完整的A分子表面有4个生物素结合位点，由上述实验结果可以推算出1个A分子约结合了13个ABA分子，表明A与ABA分子的结合并未达到饱和状态，此种结合模式减小了空间位阻，可以使ABA更灵活地与AP发生相互作用。

32APABA的特异性结合

圆二色谱（Circular dichroism， CD）可以表征DNA二级结构变化，是研究目标物对靶DNA构型变化影响的有效工具＼[25＼]。本研究利用CD技术考察AP与ABA结合时ABA的构型变化。如图3A所示，不加入AP时，ABA在约260 nm处出现正CD光谱条带，在240 nm附近出现负CD光谱条带；加入AP后，ABA在280 nm附近出现正CD光谱条带，255 nm附近出现负CD光谱条带。上述光谱变化表明，AP能够与ABA结合，且诱导ABA形成反向平行G4结构＼[26＼]。利用DPI技术研究了AP和ABA之间的特异性结合，首先对ABA进行探究，对照 ABA（Control ABA，cABA）的整个固定过程如图1（电子版文后支持信息）所示。当ABA和cABA界面层同时引入一定浓度的AP后，cABA表面的层质量并未发生明显变化，而ABA固定表面对AP产生了明显的质量变化信号（图3B），表明AP对ABA具有良好的特异性。分别将AP、CP、UP、GP及4种核苷酸的混合物流经ABA传感表面，如图2（电子版文后支持信息）所示，只有AP和同时含有4种核苷酸的混合物才能引起表面层质量的变化。上述实验结果表明，ABA对AP呈现出良好的选择性。

33DPI实时监测APABA相互作用

将ABA固定在芯片表面上，ABA传感界面注射不同浓度的AP （025～1500 μmol/L），利用DPI实时监测ABA与AP相互作用时的层质量、层厚度及层密度的变化过程。如图4A和4B所示，0～50 s，界面层的质量和厚度变化迅速增加； 50～300 s，层质量和层厚度的变化呈轻微增加的趋势。当停止引入AP后（300 s），层质量和层厚度快速下降， 并最终达到平衡状态，表明绝大部分AP与ABA传感界面结合不稳固。图4C中密度的变化呈现出相反趋势，因为芯片表面不断结合AP导致界面层的密度降低。通过分析层质量、层厚度、层密度变化发现，AP在初始阶段能够快速且大量地结合ABA；停止加入AP后，由于ABAAP复合物的不稳定性，随着缓冲溶液的引入， AP不断解离，并离开芯片表面。上述结果表明，ABA和AP的结合具有可逆性，准确测定二者之间的结合速率常数和解离速率常数，对深入了解两者的相互作用具有重要意义。

34动力学参数的测定

ABAAP结合过程中层质量的实时变化见5A。当AP流经ABA传感界面时，ABA先快速捕获AP，然后再以缓慢的速率结合。切换回缓冲液时，层质量信号显著下降，且最终达到稳定状态，表明APABA复合物出现了解离现象。根据层质量变化的曲线（图3A），ABAAP的结合速率常数（ka）和解离速率（kd）根据可由式（3）计算出＼[27＼]：

可以变换为：

其中，ka和kd分别表示结合和解离的速率常数； C是流过ABA界面的AP浓度， Rmax是ABA与AP的最大结合信号， R表示在时间t时ABA界面捕获的AP数量。基于方程（4），以dR/dt对R作线性图，斜率为：

根据图4A中层质量的变化曲线，在 125～200 s内，每25 s取一个对应的R值。根据式（4），以dR/dt对R作图，可以获得不同浓度的AP对应的斜率值（图3，电子版文后支持信息）。根据式（5），用不同浓度的AP溶液的响应值进行线性拟合，得到方程Y=466×103C + 170×10

ymbolm@@ 2， R2 = 0977，计算得ka=466×103 L/（mol ・s）（图5B）。同时，从上述方程的截距可得kd=170 ymboltB@ 10

ymbolm@@ 2 s ymbolm@@ 1。根据公式KA=ka/kd，KD = kd/ka，KA和KD分别为27 × 105 L/mol和37 × 10 ymbolm@@ 6 mol/L，与文献＼[22，28＼]报道的结果一致。

35AP的检测

基于以上的研究结果，利用构建的ABA修饰芯片，建立了一种新型传感技术用于检测AP。

由图3B和图2（见电子版文后支持信息）可知，此传感器具有良好的特异性和选择性。图5A中300 s处的层质量、层厚度和层密度对AP浓度作图。如图6所示，当AP的浓度在025～1500 μmol/L范围内增加时，层质量随之增加，将300 s处不同浓度AP在芯片表面引起的层质量变化对浓度进行线性拟合，得到拟合方程为Y=138×10 ymbolm@@ 3 + 323×10 ymbolm@@ 3C（μmol/L）（R2 = 0996），检出限为022 μmol/L（3σ），优于文献＼[29～31＼]报道的结果。根据层厚度和层密度的变化也可以检测AP，检出限分别为014和032 μmol/L（图4，电子版文后支持信息）。

为进一步证明此传感器的实用性和准确性，对血清样品进行了检测。5%血清样品（血清用risCl 缓冲溶液稀释20倍），加入不同浓度AP，用DPI检测。从表1和图5 （见电子版文后支持信息）中结果可见，加标回收率在967%～1100%之间，表明了此传感方法在实际血清检测中具有潜在应用价值。

4结 论

采用DPI实时研究了AP与ABA结合过程中层质量、层厚度及层密度的变化情况。结果表明，ABA与AP之间的结合具有可逆性。根据相互作用过程中层质量的变化，测得相互作用的速率常数ka （466 × 103 mol/L ymbolm@@ 1・s ymbolm@@ 1）、kd （170 × 10 ymbolm@@ 2・s ymbolm@@ 1）以及Y合常数KA （27 × 105 L/mol）和KD（37 ×10 ymbolm@@ 6 mol/L）。 同时，基于DPI和ABA，建立了一种新型AP传感器，通过测定层质量、厚度和密度随AP浓度的变化，传感器的检出限（LOD， 3σ）分别为022、014和032 μmol/L。 DPI作为一种无标记、实时、快速、灵敏的技术，不仅能够在纳米尺度研究生物分子间的相互作用，而且在生物传感领域具有极大的应用潜力。

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