转Bt基因油菜的抗虫性分析
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摘要：利用农杆菌介导的遗传转化分别将Cry1C和Cry2A的2个单价bt基因转入油菜（Brasica napusL.），以两个纯合的转基因抗虫油菜为亲本，通过有性杂交的方法将不同Bt基因聚合，培育双价Bt抗虫油菜，并对其抗虫性和种子品质性状进行评价。结果表明，Cry1C、Cry2A在聚合后均能稳定表达，和单价Cry1C转基因植株相比，双价株系中蛋白质含量明显降低，以Cry2A为母本的聚合株系蛋白质含量降低更多，Cry1C在遗传上存在母本效应。室内接种小菜蛾二龄幼虫结果显示，转化单价和双价聚合Bt基因的抗虫性增强，其中转化单价Cry1C的抗虫性优于双价聚合Bt基因和单价Cry2A基因的转基因植株。玻璃温室栽培转基因植株，单价Bt和双价聚合Bt基因的转基因植株能生存而非转基因植株受到严重虫害而死亡。对抗性优良的单价和双价聚合的转基因植株种子品质测定发现，与未受到虫害的受体材料双低优良恢复系7-5的含油量和硫苷含量差异不显著，从而达到抗性改良的目的。
关键词：油菜（Brassica napus L.）；苏云金芽孢杆菌；Cry1C；Cry2A；双价聚合；农杆菌介导遗传转化；品质性状
中图分类号：Q785 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）09-2386-06
油菜（Brassica napus L.）在生长发育过程中容易受到虫害的侵袭，有10多种害虫在油菜生产上能大面积发生并造成严重减产。近年来，气候变化使得虫害日趋严重。对农业生产造成损失。尽管使用化学农药能够取得良好的防控效果，但是农药残留对环境和人体的健康产生的危害已引起广泛的关注。利用转基因技术将抗虫基因转入油菜中，可以一定程度上改良油菜的抗虫性。转基因抗虫植物最重要的基因来源于微生物的抗虫基因，即苏云金芽孢杆菌杀虫基因（Bt）。Bt杀虫晶体被昆虫摄入后，经历了晶体蛋白溶解、原毒索酶解活化、与中肠受体结合、不可逆插入膜内、形成离子通道五个阶段最后实现杀虫效果。根据杀虫晶体蛋白的杀虫特异性以及氨基酸序列的同源性标准将发现的42种杀虫蛋白基因分为7大类。其中类型Ⅰ（CryⅠ）抗鳞翅目（Lepidoptera）昆虫，类型Ⅱ（CryⅡ）抗鳞翅目和双翅目（Diptera）昆虫，类型Ⅲ（CryⅢ）抗鞘翅目（Coleoptera）昆虫，类型Ⅳ（CryⅣ）抗双翅目昆虫，CryⅤ对鳞翅目和鞘翅目以及线虫特异，CryⅥ对线虫特异，这六类统称为晶体蛋白基因家族（Crvstalprotein gene，cry）。CrtA对双翅目特异，与Cry基因完全不同，属于细胞外毒索（Cvtolvtic protein，Cyt）。Bt产生的晶体蛋白对鳞翅目昆虫具有特异的毒性，作为一种生物杀虫剂在农业害虫防治中广泛应用。通过人工修饰Bt基因，如位点特异性突变的Crv3Bbl毒蛋白在玉米中表达可提高其对根虫的抗性。1990年Monsanto公司首次在转Bt抗虫棉中获得人工修饰的CryIA（6）和CryIA（c）基因，这2个基因在植株中蛋白含量占总可溶性蛋白的0.05%-0.10%。Cry基因与植物基因密码子上的差异导致转入植物体内转录过程形成二级结构，mRNA的稳定性下降以及翻译效率降低，来自苏云金芽孢杆菌的5个δ-内毒素Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1C、Cry2A和Cry9C能够与蛀茎虫三化螟和二化螟中肠不同受点结合，利用毒性蛋白与刷状缘膜囊结合能力竞争性试验分析得出不同Bt基因抗虫效果的差异。华中农业大学水稻课题组人工合成Bt基因Cry1Ac、Cry2A、Cry1C和Cry9C转入优良水稻恢复系明恢63中，获得对两种主要水稻钻蛀害虫三化螟和二化螟抗性优良的转基因家系。对苏云金芽孢杆菌的Cry1Cal进行截短，依据单子叶植物偏好来提高Bt基因的GC含量转化到粳稻品种秀水11中能提高转基因水稻对斜纹夜蛾和钻蛀虫的抗性。
随着Bt作物的普遍商业化种植给目标昆虫群体造成了极大的选择压，产生了昆虫克服抗性的巨大风险。小菜蛾（Plutella xylostella）是迁飞害虫，主要危害十字花科植物，对几乎所有类型的化学杀虫剂都产生过抗性。在1990年田间发现了对Bt蛋白产生抗性的小菜蛾，是首次在自然条件下发现对Bt杀虫蛋白产生抗性的昆虫，是长期使用Bt制剂的产物，可以利用不同Bt基因聚合延缓昆虫抗性。Tu等2000年利用水稻ActinⅠ启动子驱动两个Bt基因cry1A（6）和cry1A（c）基因融合表达载体转化明恢63恢复系和杂交种汕优63。Bt汕优63在自然条件以及室内接种水稻钻蛀害虫三化螟表现出很好的抗性，并且不会带来产量损失。
本研究采用农杆菌介导法，以Bar基因作为抗性筛选标记，将华中农业大学水稻课题组人工合成的Bt基因Cry2A和Cry1C转入到甘蓝型油菜Pol-CMS优良恢复系材料7-5中，获得抗虫性改良的转基因家系。另外。将分别转化2个基因的植株杂交聚合，对杂交后纯合转基因家系进行抗虫性评价，以期为转Bt基因油菜的抗虫性研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
供试的甘蓝型油菜为华中农业大学油菜室所提供的优良PolCM双低恢复系7-5。选取干净饱满油菜种子，75%乙醇消毒1min，0.1%HgCl2溶液表面灭菌15min，无菌水冲洗3次，置于MS固体培养基上发芽。取生长6d的无菌苗下胚轴，用于试验材料。植物表达载体pCAMBIA-Ubiquitin promoter-Cry1C和oCAMBIA-Ubiquitin promoter-Cry2A为华中农业大学水稻转化课题组林拥军教授提供。大肠杆菌Top10和根癌农杆菌GV3101由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室油菜课题组保存。DNA聚合酶购自Promega公司，DNA marker购自Takara公司。田间喷施Basta购自Bayer公司。