射干地龙颗粒对鸡的亚慢性毒性试验
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摘要：为研究射干地龙颗粒的安全性，将120只21日龄的三黄肉鸡，随机分为3倍剂量组、6倍剂量组、12倍剂量组和对照组，观察射干地龙颗粒对鸡的心、肝、脾、肺、肾脏和血液等组织的影响。结果表明，各组鸡的体重、脏器指数以及血常规指标组间差异总体不显著（P>0.05），血清丙氨酸氨基转移酶活性及肌酐含量与药物剂量间呈现无规律性变化，白蛋白含量和尿素含量与对照组差异不显著（P>0.05）。在用药后，各组鸡的心、肝、脾、肺和肾脏均无明显差异，表现正常。
中图分类号：S858.31 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）04-0878-05
Study on Subchronic Toxicity of Shegan Dilong Particles in Chicken
WANG Gui-bo1，WANG Dong-sheng1，XIE Jia-sheng1，ZHENG Ji-fang1，LUO Chao-ying1，LI Jin-yu1，
LUO Yong-jiang2，XIN Rui-hua2，LI Xiao-rong3
（1.Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences， Chinese Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730050，China；
2.Key Laboratory of Veterinary Pharmaceutical Development， Ministry of Agriculture，Lanzhou 730050，China；
3.Institute of Livestock Grass and Green Agriculture， Gansu Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730070，China）
Abstract： In order to evaluate the safety of Shegan Dilong particles， 120 21-day-old Sanhuang broilers were randomly divided into four groups including the 3-fold dose group， 6-fold dose group， 12-fold dose group and the control group. The impact on the chicken’s heart， liver， spleen， lung， kidney and blood were observed. The results showed that the difference of overall weight， organ index and blood indicators in each group of chicken was not significant（P>0.05）， while there was no regularity between the serum alanine aminotransferase activity， creatinine concentration and drug dosage of each group while the content of albumin and urea had no significant differences compared with the control group（P>0.05）. After administration， the performance of chicken’s heart， liver， spleen， lung and kidney were not significantly different from normal in all groups. Key words： Shegan Dilong particles； chicken； subchronic toxicity； physiological and biochemical indexes
随着鸡群养殖的集约化程度越来越高，鸡呼吸道疾病成为当前养鸡业中具有严重危害的一类疾病，造成了巨大的经济损失，而且还影响了相关产品的品质。目前鸡呼吸道疾病的治疗多采用疫苗紧急免疫或者西药治疗，而疫苗免疫具有免疫失败的潜在危险性，西药治疗又极易产生细菌耐药性。中药治疗则避免了此类问题的发生，又符合当前人们对畜产品安全性的需求。
射干地龙颗粒是纯中药制剂，具有调节免疫力、解热镇痛、抑制病毒复制、抗菌消炎和高效低毒等功效。根据新兽药报批的要求，研究射干地龙颗粒对鸡的亚慢性毒性，即对受试鸡长期喂饲不同剂量的药物，可以了解药物对鸡的毒性作用、确定药物的最大无作用剂量，了解药物是否具有致畸作用和致癌作用，对药物的安全性作出客观评价，并为其临床应用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验用药 射干地龙颗粒由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所研制，主要由射干、地龙、北豆根、甘草等中药成分组成。
1.1.2 仪器及试剂 迈瑞BS-420型全自动生化分析仪购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；AUW120D电子天平购自日本岛津公司；LEICA RM2025型组织切片机、LEICA TP1020型组织脱水机购自德国Leica公司；CK-2型倒置显微镜购自日本Olympus公司；CELL-DYN3200血细胞分析仪购自美国雅培公司；天门冬氨酸氨基转移酶试剂盒（批号：0030）、丙氨酸氨基转移酶试剂盒（批号：0061）、白蛋白试剂盒（批号：140909027）、肌酐试剂盒（批号：0037）和尿素试剂盒（批号：0051）均购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司。
1.1.3 试验动物 三黄肉鸡购自兰州市西固区华陇鸡场，在中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所标准化实验动物房适应性饲喂一周。将鸡随机分为4组（每组30只）：3倍剂量组、6倍剂量组、12倍剂量组和对照组。
1.2 试验方法
1.2.1 给药方案 根据试验鸡21日龄时的平均体重，对3倍剂量组、6倍剂量组和12倍剂量组分别按照正常治疗剂量（500 mg/kg）的3倍、6倍和12倍量将药物均匀混入饲料进行饲喂，要求当日必须净槽，连续饲喂两周。14 d后再次称取鸡只体量，按照以上给药方案重新计算给药量，拌料饲喂两周。对照组不给予任何药物，进行正常饲喂。
1.2.2 体重和脏器指数观察测定 每天观察各组鸡的健康状况，包括活动、采食、饮水、发病和死亡等。第14天时各组鸡随机选取10只称重，然后心脏采血和剖检。第28天时各组剩余鸡再随机选取10只重复上述操作。剖检观察鸡的实质性脏器有无眼观病理变化，对心、肝、脾、肺、肾称重并计算脏器指数（脏器湿重/体重×100%）。组织切片取材，4%甲醛固定48 h后做组织切片，经HE染色后进行显微镜观察。
1.2.3 血常规指标测定 用CELL-DYN3200血细胞分析仪进行血常规分析，主要测定白细胞（WBC）数、淋巴细胞百分比、单核细胞百分比、中性粒细胞百分比、红细胞（RBC）数、血红蛋白（HGB）含量、血小板（PLT）数。用迈瑞BS-420型全自动生化分析仪测定血清中肌酐含量、尿素含量、白蛋白（Albumin，ALB）含量、天门冬氨酸氨基转移酶（Aspartate aminotransterase，AST）和丙氨酸氨基转移酶（Alanine aminotransferase，ALT）活性。
1.2.4 数据统计 所有数据均用x±s表示，用SPSS 14.0软件进行方差分析。P
2 结果与分析
2.1 射干地龙颗粒对鸡体重的影响
在给药0、14、28 d后，各给药组鸡的平均体重与对照组相比显著不差异（P>0.05）（表1），结果表明射干地龙颗粒对鸡体重增长无明显影响。
2.2 射干地龙颗粒对鸡脏器指数的影响
在连续给药14 d和28 d后，各给药组鸡的脏器指数与对照组均无显著差异（P>0.05）（表2），结果表明射干地龙颗粒对鸡脏器无明显影响。
2.3 射干地龙颗粒对鸡血常规指标的影响
连续用药14 d后3倍剂量组鸡的淋巴细胞百分比显著高于对照组（P
连续用药28 d后各给药组指标变化仅12倍剂量组中性粒细胞比例显著低于对照组（P0.05）（表4）。
2.4 射干地龙颗粒对鸡生化指标的影响
连续给药14 d后各组鸡的血清ALT活性与对照组相比，3倍剂量组呈现显著下降（P0.05），结果表明，连续给药射干地龙颗粒14 d后对AST活性和白蛋白含量影响较小。连续用药14 d后各组鸡的血清肌酐含量与对照组相比，3倍剂量组显著下降（P0.05）；对照组鸡的尿素含量与其他各给药组间均差异不显著（P>0.05）（表5）。
连续用药28 d后各组鸡与对照组相比，ALT活性仅6倍剂量组显著降低（P0.05），3倍剂量组和6倍剂量组极显著低于对照组（P0.05）。与对照组相比，连续用药28 d后各给药组鸡的血清肌酐含量，仅3倍剂量组差异显著（P0.05）（表6）。
2.5 鸡脏器剖检结果
连续用药14 d和28 d后，各给药组鸡的心、肺、脾和肾脏均未出现明显的异常。心脏在质地方面均没有明显的眼观异常，心脏为圆锥体、颜色粉红，心包膜及心包液透明，闰盘结构完整，心肌纤维致密和肌纤维束分布均匀，细胞核和胞浆均匀。肺脏在质地方面也均没有明显的眼观异常，肺扁平呈长四边形海绵状，颜色粉红，有结构完整、分布均匀、大小不等的肺泡。脾脏在质地方面没有明显的眼观异常，如球体，颜色棕红，脾束、脾血窦和小静脉结构明显，淋巴细胞均匀分布，皮质、髓质结构完整。肾脏在质地方面均无明显的眼观异常，肾脏为红褐色，呈长条状，质软，肾小体、近曲小管和远曲小管结构完整，肾小管密集，细胞核大小一致，分布均匀。肝脏在质地方面没有明显的眼观异常，呈红褐色，肝组织以肝细胞及中央静脉为中心，呈放射状排列，肝细胞呈梁索状。
3 小结与讨论
3.1 射干地龙颗粒的作用机制
射干地龙颗粒以射干和地龙为主药。在传统的射干麻黄汤的基础上加味，集射干的开结消痰和地龙的平喘定哮及化痰镇咳的作用于一体。组方中其他药味具有降逆化饮、散寒行水、温润除痰、下气止咳和益脾养胃等功效。各药配伍使用可起到宣肺散寒、化饮止咳的功效，适用于鸡咳喘性呼吸道病的治疗。异黄酮类化合物是射干的主要提取物，可发挥抗炎镇痛的作用，其作用机制主要是抑制受到脂多糖的诱导的氧化亚氮和前列腺素E2的生成，从而发挥作用而成为抗炎的先导化合物[1]。射干的提取物还能够抑制血栓素A2的合成和促进前列环素的合成而发挥祛痰平喘的药理效应。研究表明射干可以显著提高免疫力而抑制小鼠血清中IgM的含量，从而证明射干可以增强小鼠的体液免疫[2]。地龙中含有的琥珀酸能够阻滞组胺受体，从而起到缓解气管痉挛和使毛细血管通透性增加的作用[3]；陈随清等[4]研究表明地龙可以对侵害肺部感染的常见病菌起到抑制作用。射干地龙颗粒具有抗炎镇痛、缓解支气管平滑肌痉挛、提高机体免疫力和促进炎症物质吸收等作用，适合作为治疗鸡传染性呼吸道病的复方制剂。
3.2 射干地龙颗粒对鸡体重和脏器指数的影响
体重和脏器指数可以反映药物对动物的影响，并作为衡量药物毒性的重要指标。其值的升高或降低可以不同程度地反映机体对药物的敏感性及脏器的充血、水肿、增生或萎缩、退变等情况。该研究表明在连续用药14、28 d后各组鸡体重与对照组相比均无显著差异（P>0.05），故射干地龙颗粒对鸡体重和脏器指数影响较小。
3.3 射干地龙颗粒对鸡血常规指标的影响
药物对机体的血液毒性常通过血常规指标来说明。红细胞、血红蛋白、白细胞与血小板数量在连续用药14、28 d后组间均差异不显著（P>0.05）。虽然鸡的红细胞为有核细胞，但由于应用了ELL-DYN3200血细胞分析仪进行血细胞计数，通过特殊的新美蓝试剂染色后再将标本进行分析，从而确保了红细胞计数数值的准确性；应用激光法对血小板进行检测，使血小板和血细胞能够得到精确的区分[5]。在连续用药14 d时低剂量组的淋巴细胞数显著高于对照组（P
3.4 射干地龙颗粒对肝肾功能指标的影响
多数药物在体内经过肝脏转化的过程中，都会对肝脏造成损害，且损伤的程度与药物剂量和浓度等有关。而肝脏的损伤就会导致ALT和AST活性及白蛋白含量的升高，因此常用ALT和AST活性并结合白蛋白含量来说明药物对动物肝细胞的损伤程度。该研究中各给药组鸡血清ALT活性与药物剂量间呈无规则变化，且低于对照组，不具有临床意义。6倍剂量组和3倍剂量组的血清AST活性虽在用药28 d后比对照组显著降低（P0.05）及ALT活性的结果，并不能说明6倍剂量和3倍剂量的药物会对鸡的肝细胞造成损伤。研究表明在肝脏受损伤的同时前列腺素（Prostaglandin，PG）的含量会降低，而PG通过作用于甾体类激素影响特异蛋白的合成。AST活性的降低可能与药物组方中甘草的主要成分甘草甜素可以调节PG的合成速度，使甾体类激素通过肝细胞核上的受体减弱了AST特异基因的表达，从而影响了酶蛋白合成[8-10]。一些药物的原形及代谢产物从肾脏排泄过程中也会损害肾脏[11]。该研究中血清肌酐含量与药物浓度间呈无规律变化，结合尿素含量组间差异不显著（P>0.05）的结果，表明在试验剂量范围内该药物对肾功能的影响较小。
3.5 射干地龙颗粒对鸡脏器病理变化的影响
在用药14、28 d后各给药组鸡的心、脾、肺和肾脏在颜色质地方面没有明显的眼观异常，除对照组一只鸡出现肝周炎、12倍剂量组一只鸡肝脏出现坏死斑点外其余鸡的肝脏在颜色质地方面均表现正常。经HE染色后，显微镜下观察，各组鸡的心、肝、脾、肺和肾脏均无明显差异，表现正常。表明射干地龙颗粒对鸡脏器病理变化的影响较小。
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