加味玉屏风缓释微丸免疫作用研究
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《中兽医医药杂志》2015年第三期
1方法
1.1白细胞分类计数采集各组小鼠静脉血1mL，采用Beckmanhmx五分类血液分析仪，按仪器操作规程操作，每份标本平行测定3次，记录结果。配套试剂均为Beckmancoulter原装进口试剂：⑴IsotonⅢ稀释液；⑵Lysesdiff溶血素；⑶Conterclenz清洗液；⑷Scatterpak散射包；⑸Couter詳5C詳cellcontrol五分类质量控制全血，随机加在标本中质控一次。
1.2玫瑰花环形成试验[2]取小鼠肝素抗凝血2mL加入试管中，加等量Hank’s液稀释。将上述稀释的抗凝血用毛细吸管沿管壁缓慢加到含4mL淋巴细胞分离液的离心管中，使加入的混合液重叠于分层液上，形成明显的分界面（注意不要摇动）。2000r/min水平离心20min，取出用毛细吸管吸出白色单核细胞层，转移入新离心管中，以5倍体积的Hank’s液混匀，1500r/min离心15min，重复3次。台盼蓝检查细胞活力，确保活细胞占细胞总数的95％以上。用Hank’s液配成1.0×107个/mL细胞悬液。将阿氏液保存的绵羊血红细胞吸去上清液后，取0.02mL沉淀细胞，用Hank’s液洗涤3次，1500r/min离心10min，将压积绵羊血红细胞用Hank’s液配成0.5%绵羊血红细胞悬液。取淋巴细胞悬液、0.5%绵羊血红细胞悬液各0.1mL，与犊牛血清20μL混合均匀，500r/min离心5min，弃上清液，摇匀后加0.8%戊二醛0.1mL，静置5min后取1滴涂片，瑞氏染色后高倍镜下计数。淋巴细胞周围吸附3个或3个以上绵羊血红细胞，即为玫瑰花环形成细胞，计数200个淋巴细胞，计算玫瑰花环形成细胞百分数。
1.3血清中IgG含量测定按照试剂盒提供的方法，用艾本德半自动生化分析仪进行测定。
1.4淋巴细胞转化率的测定按照参考文献[2]方法进行测定。
1.5嗜中性粒细胞吞噬力测定按照参考文献[3]方法制备金黄色葡萄球菌（ATCC6538）细菌悬液，按照参考文献[4]方法制备中性粒细胞悬液，取粒细胞悬液40μL放入无菌的凹玻片内静置，加制备好的金黄色葡萄球菌菌液20μL，充分摇匀后置于铺有湿纱布的37℃温箱预温的有盖容器内，37℃培育40min，其间每隔10min摇匀1次，取上清液涂片，进行瑞氏染色。油镜下观察中性粒细胞吞噬细菌的情况。
1.6白细胞趋化试验在趋化因子作用下，中性粒细胞沿趋化因子的浓度梯度作定向移动，根据其在琼脂糖胶板上移动的距离，判定白细胞趋化功能。将大肠埃希氏菌（ATCC8099）接种于M199培养基中，37℃培养过夜，2000r/min离心15min，微孔滤膜过滤除菌，后调节pH值至7.0左右，制备成趋化因子。白细胞悬液的制备方法参照参考文献[5]进行，56℃水浴将融化的琼脂糖胶液与等体积预温的2倍浓缩营养液混匀。在洁净载玻片上浇注混合溶胶3mL，置于4℃冰箱中30min使其充分凝固，后在凝胶上打孔，孔径3mm，每个待测样品加3个孔，孔距2mm，最上孔中加入趋化因子，中间孔加入白细胞悬液，下孔加入M199培养液作对照，每孔加样量均为10μL。将玻片置于加有湿纱布的饭盒内，在5％CO2培养箱内37℃作用6h。从培养箱中取出玻片，甲醇浸泡30min，后剥去胶膜，吉姆萨染液染色10min后镜检。用测微器（40×）观察白细胞向上孔移动的距离（mm），称为趋化移动距离，白细胞向下孔移动距离称随机运动距离，两个距离的比值即为趋化指数。每份样品以3孔均值计算。
2结果
2.1加味玉屏风缓释丸对小鼠白细胞分类计数的影响见表1。通过表1可以看出，注射环磷酰胺后小鼠白细胞总数较正常饲喂组显著降低（P<0.05），极显著低于灌服加味玉屏风缓释微丸且不注射环磷酰胺的阳性对照组（P<0.01）；不同处理对中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞所占比例的影响较小，各组差异不显著（P>0.05），但是注射环磷酰胺可以极显著降低中性粒细胞中分叶型核的比例（P<0.01），极显著增加杆状型核的比例（P<0.01）。
2.2加味玉屏风缓释丸的免疫增强作用结果见表2。由表2可以看出，注射环磷酰胺可显著降低小鼠T淋巴细胞玫瑰花环数量（P<0.05），灌服加味玉屏风缓释微丸后能显著提高小鼠血液玫瑰花环数量（P<0.05），灌服加味玉屏风缓释微丸且不注射环磷酰胺的阳性对照组玫瑰花环数量较其他3组均升高，与免疫抑制组差异极显著（P<0.01）；与对照组相比，注射环磷酰胺可降低血清中IgG含量，阳性对照组血清中IgG含量升高，两者比较差异显著（P<0.05），其他组差异均不显著；注射环磷酰胺可降低淋巴细胞转化率，但差异不显著（P>0.05）；注射环磷酰胺可降低嗜中性粒细胞吞噬指数，与阳性对照组差异显著（P<0.05），其他各组差异不显著；注射环磷酰胺可降低白细胞趋化指数，与阳性对照组相比差异极显著（P<0.01），与普通对照组和治疗组相比差异显著（P<0.05）。说明加味玉屏风缓释微丸有提高机体白细胞趋化指数的功能。
3结论
本研究在加味玉屏风缓释微丸的非临床研究阶段，通过注射环磷酰胺建立了免疫抑制小鼠模型，并以该模型评价药物对血液免疫功能的作用，结果证实该药物对玫瑰花环形成率、血清中IgG含量、嗜中性粒细胞吞噬指数、分叶型核比例、淋巴细胞转化率、白细胞趋化指数等免疫指标均有不同程度的促进作用，具有统计学意义，证实该药物具有提高机体免疫功能的作用。
作者：孟妍 尚磊 梁立 梁运霞 单位：黑龙江职业学院