浒苔水煎提取物的抑制作用

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《中兽医医药杂志》2015年第三期

1浒苔水煎提取物抗病毒试验

1.1不同浓度ED对PRRSV的抑制作用将Marc145细胞在12孔细胞培养板上培养至单层，弃掉孔内培养液，分别加入不同浓度（20%、25%、30%、35%、40%、45%和50%）的ED-DMEM1mL，置于二氧化碳培养箱继续培养2h，将孔内ED-DMEM置换为维持液（含4%新生牛血清），接种PRRSV（0.01MOI），置二氧化碳培养箱继续培养，观察细胞变化，并于48h后收获病毒：将细胞板反复冻融3次，12000r/min离心15min，吸取上清液，测定其TCID50。每个浓度设置3个平行试验，同时设立仅ED处理和仅病毒接种对照组。

1.2病毒接种前或后ED处理细胞对PRRSV的抑制作用用2×DMEM将ED稀释至50%浓度（50%ED-DMEM），将Marc145细胞在12孔细胞培养板上培养至单层，第1组将孔内培养液换成50%DMEM-ED，置于二氧化碳培养箱继续培养2h后，接种PRRSV（0.01MOI）；第2组换成维持液（含4%新生牛牛血清的1×DMEM），接种PRRSV（0.01MOI），吸附2h后，弃掉孔内液体，加入50%DMEM-ED，置于二氧化碳培养箱继续培养，观察细胞变化，并于48h后收获病毒：将细胞板反复冻融3次，12000r/min离心15min后吸取上清液，测定其TCID50。每个组设置3个平行试验，同时设立仅ED处理和仅病毒接种对照组。

1.3ED持续作用对PRRSV的抑制作用用2×DMEM将ED稀释至50%（50%ED-DMEM）浓度，将Marc145细胞在12孔细胞培养板上培养至单层，移除孔内培养液，加入50%DMEM-ED1mL，置于二氧化碳培养箱继续培养2h后，一组弃掉孔内培养液，换成维持液，接种PRRSV（0.1MOI）；另一组不换液，直接接种PRRSV（0.1MOI），接种病毒后，置于二氧化碳培养箱继续培养，观察细胞变化，并于48h后收获病毒：将细胞板反复冻融3次，12000r/min离心15min后吸取上清液，测定其TCID50。每个组分别设置3个平行试验，同时设立仅ED处理和仅病毒接种对照组。

1.4ED作用不同时间对PRRSV的抑制作用将Marc145细胞在12孔细胞培养板上培养至单层，将孔内培养液换成50%DMEM-ED，置于二氧化碳培养箱继续培养，分别于ED处理1、2、3h后接种PRRSV（0.01MOI），继续培养，观察细胞变化，并于48h后收获病毒：将细胞板反复冻融3次，12000r/min离心15min后吸取上清液，测定其TCID50。每个作用时间设置3个平行试验，同时设立仅ED处理和仅病毒接种对照组。

1.5ED对不同接种量PRRSV的抑制作用将12孔细胞培养板上培养至单层的Marc145细胞孔内培养液换成50%DMEM-ED，置于二氧化碳培养箱继续培养，2h后将孔内液体换成维持液（含4%新生牛血清），分别接种0.01MOI和0.1MOIPRRSV，继续培养，于病毒接种后48h收获病毒液，并测定其TCID50。每个病毒接种量设置3个平行试验，同时设立仅ED处理和仅病毒接种对照组。

2结果

2.1浒苔水煎物多糖提取浒苔水煎物多糖提取（ED）经冻干、称重，计算其多糖提取率为12.56%。

2.2浒苔水煎提取物对淋巴细胞的细胞毒性浒苔水煎提取物对Marc145细胞的细胞毒性结果见表1。从表1结果可见，样品的OD值均高于对照组，25%的浒苔水煎提取物处理组OD值高于空白对照组，但差异不显著（P>0.05）；50%浒苔水煎提取物处理组OD值高于空白对照组，差异显著（P<0.05）。2.3浒苔水煎提取物对PRRSV的抑制作用

2.3.1不同浓度ED的抗病毒作用以20%、25%、30%、35%、40%、45%和50%七个浓度的ED处理Marc145细胞，作用2h后接种0.01MOI的PRRSV，接种病毒后30h，观察CPE见图1。病毒接种后48h收获病毒液，检测其TCID50结果见表2。ED处理组与对照组相比，病毒滴度降低，差异显著（P<0.05）。

2.3.2ED对不同接种剂量病毒的抑制效果Marc145细胞用50%ED处理2h后分别接种0.01MOI和0.1MOI的PRRSV，病毒接种35h，观察CPE见图2。感染48h后收获病毒液，检测其TCID50，两个组的病毒滴度与对照组比较均显著降低（P<0.05），但0.1MOI组和0.01MOI组之间差异不显著（P>0.05）。

2.3.3ED持续作用对PRRSV的抑制效果用50%ED处理Marc145细胞，2h后一组换为维持液，另一组持续作用（不换液），两个组均接种0.01MOIPRRSV，感染35h后观察CPE见图3。感染后48h收获病毒液，并检测其TCID50。ED持续作用组病毒滴度为0，显示PRRSV增殖完全被抑制，结果见表4。

3讨论

对浒苔利用的研究包括食用性、免疫增强、抗氧化、抗肿瘤、抗炎等，而浒苔多糖糖抗微生物的研究也有报道，如有学者研究表明，海藻水溶性多糖可明显促进人体淋巴细胞的增殖；另有学者对13种韩国海藻甲醇提取物的抗病毒活性进行了研究，发现其中浒苔的甲醇提取物具有良好的抗单纯疱疹病毒（HSV）、Sindbisvirus（SINV）和脊髓灰质炎病毒（Poliovirus）的活性。据报道，两种大型海藻———羊栖菜、条浒苔的乙醇提取物对11种水产动物病原菌均表现出较强的抑制作用，浒苔多糖具有防治右旋葡聚糖硫酸钠致小鼠溃疡性结肠炎的作用；热带海藻石莼和马尾藻属的围氏马尾藻提取物具有较强的抗副溶血弧菌活性。

本研究结果显示，浒苔水煎提取物（ED）预处理Marc145细胞对PRRSV有明显的抑制作用，以2倍浓度的DMEM稀释ED保证细胞培养液的成分，在此前提下，ED浓度与其病毒抑制作用呈正相关趋势，但如病毒先吸附细胞，ED对病毒的抑制作用降低，可能的原因是提取物成分与游离的病毒粒子发生直接反应而影响了病毒对细胞的吸附，或者ED作用于细胞受体，降低了病毒感染细胞的机会；对于已完成吸附过程和进入细胞内部的病毒粒子，吸收入细胞的ED成分可发挥作用，因而病毒感染细胞后培养液中持续存在的ED可完全抑制PRRSV的增殖。浒苔提取物中成分复杂，今后研究中应将其用乙醇浸提，对醇溶成分和乙醇沉淀成分分别进行试验，对该提取物抗病毒的有效成分和机理作进一步深入探讨。

作者：沈美艳 张广斌 孙秋艳 李舫 姜凌功 单位：山东畜牧兽医职业学院 山东省高唐县畜牧水产局