心肌缺血预处理对未成熟心肌细胞凋亡的影响

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作者：孙忠东，池一凡，杨铁南，侯文明，牛兆倬，唐子龙 【关键词】 缺血预处理

摘要：目的 探讨心肌缺血预处理(MIP)对未成熟心肌bcl-2、bax、fas蛋白表达的影响。方法 采用兔Langendorff模型，24只幼兔随机分为3组，对照组(C,n=8)：仅灌注KH液180min，然后取标本；缺血/再灌注组（I/R, n=8）：灌注20min后，停灌45min，复灌120min；心肌缺血预处理组(MIP, n=8)，灌注20min，反复2次停灌5min，复灌5min，然后重复I/R组缺血/再灌方法。以凋亡细胞原位标记、琼脂糖凝胶电泳检测DN段梯及bcl-2、bax、fas蛋白表达作为检查指标。结果 琼脂糖凝胶电泳检测DN段梯：MIP组与I/R组比较，光密度明显减弱； MIP组与I/R组比较，bcl-2表达明显增多，bax、fas表达明显减少。结论 MIP通过影响bcl-2、bax、fas基因蛋白的表达减少心肌细胞凋亡。

关键词： 缺血预处理；心肌；细胞凋亡；基因蛋白

The Effects of Myocardial Ischemic Preconditioning on Immature Myocardial Cell Apoptosis

Abstract: OBJECTIVE To investigate the effects of myocardial ischemic preconditioning (MIP) on immature myocardial cell apoptosis and expression of bcl-2,bax,fas protein .METHODS Isolated working rabbit heart model was used in this study, 24 rabbits (aged 14～21 days) were divided into 3 groups (n=8) . Control group was only perfused with Krebs-Henseleit (KH) 180 minutes. Ischemia/reperfusion(I/R) group was perfused 20 minutes ,and then kept under ischemia 45 minutes, followed by reperfustion 120 minutes. Myocardial ischemic preconditioning (MIP) group was perfused 20 minutes ,and then repeatly ischemia 5 minutes followed reperfusion 5 minutes 2 times,finnaly reperfused 120 minutes. Such indexes, including the TUNEL, nucleosomal ladder of DNA fragments, and the expression of bcl-2, bax,and fas gene were detected.RESULTS MIP group there was reduction in TUNEL cell apoptosis, ladder of DNA fragments,expression of bax and fas gene,and increase in expression of bcl-2 gene.CONCLUSION This study demonstrated that MIP decrease immature myocardial cell apoptosis by affecting the expression of bcl-2, bax,and fas gene .

Key words：Ischemic preconditioning;Myocardial; Apoptosis;Gene proteins

细胞凋亡(apoptosis)是指有核的细胞在一定条件下通过启动自身的机制而发生的一种自然死亡过程。细胞凋亡广泛参与机体的正常发育和各种病理生理过程。细胞凋亡发生不足或凋亡过度均可以导致机体发生多种病理生理变化。在成熟心肌实验表明MIP可减少心肌细胞凋亡的发生，其中bcl-2、bax、fas等基因蛋白的表达在细胞凋亡中起重要作用。MIP对未成熟心肌细胞凋亡有否影响，尚未可知。本实验目的观察MIP对未成熟心肌细胞凋亡和bcl-2、bax、fas等基因蛋白的表达的影响。

1 材料与方法

1.1 动物模型的建立

出生14~21d的健康新生长耳大白兔24只，雌雄不拘。开胸，右心耳注入肝素(300IU/kg)，切开主动脉插入灌注管，即行KH液Langendorff灌流，灌注压为45mmHg。切取心脏，结扎肺静脉，剪开左心耳将内径3mm左房灌注管插入左房，内径1mm测压管插入左心室。左房灌注压为7.5mmHg，左心后负荷为22.5mmHg。KH 缓冲液成分(mmol/L) :NaCl 118.5, KCl 4.70,CaCl2 2.50, MgSO4 1.20, NaHCO3 25.00, KH2PO4 1.20, Glucose 11.10,Na2EDTA 0.50。使用时新鲜配制，经0.45μm 滤器过滤，灌流前给予体积分数为95%O2和5%CO2混合气体按1.5L/min向储液瓶内的灌流液中通气30min，灌流液维持在37℃，pH为7.4，渗透压为320~330mOsm/L。

1.2 分组及方法

随机分为3组,常规建立Langendorff模型。①对照组（C）组：仅灌注KH液180min，然后取标本。②缺血/再灌(I/R)组：灌注20min后，停灌45min，复灌120min。③MIP组：灌注20min，反复2次停灌5min/复灌5min，然后重复I/R组缺血/再灌方法。

1.3　检测指标及方法

凋亡细胞原位标记与半定量分析 左室心肌组织常规石蜡包埋，采用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT酶)介导的带荧光的dUTP缺口末端标记法(terminal transferase UTP nick end labeling,TUNEL)［1］标记凋亡细胞核中DNA3′-OH末端，经脱蜡，洗脱，消化，孵育，洗脱，NBT-BCIP显色，镜下观察。根据凋亡阳性细胞分布情况，每张切片拍摄5个阳性视野，每视野记数300个心肌细胞中阳性细胞数，以平均计算阳性细胞所占的百分比作为凋亡细胞阳性指数(AI)。

琼脂糖凝胶电泳检测DN段梯 采用快速法检测DN段梯［2］。

Bcl-2、bax、fas基因蛋白的表达 采用Western blot法。用2×SDS样品缓冲液裂解细胞，收集细胞蛋白质，经SDS-PAGE分离后迅速转移至尼龙膜，按《分子克隆实验指南》加入单抗(1:1000)及碱性磷酸酶偶联的抗小鼠IgG(1:1000)用BCIP/NBT显色［3］。

1.4 统计学处理

数据以均数±标准差（ ±s）表示，采用方差分析方法，P<0.05差异有显著性。

2 结果

2.1 亡细胞原位标记与半定量分析

见表1，图1~3。MIP组的细胞凋亡率为(4.62±1.25)，与I/R组的(12.30±2.10)比较P<0.01，具有显著性差异。表1 心肌细胞凋亡率（略）注：MIP与I/R相比 P<0.01。

2.2　琼脂糖凝胶电泳检测DN段梯

见图4。MIP组DN段梯与I/R组比较明显减弱，用MPIAS-1000型多媒体病理图象分析系统进行光密度测定，与I/R组比较P<0.01，具有显著性差异。

2.3 Bcl-2、bax、fas基因蛋白的表达

见图5~7。

Bcl-2基因蛋白的表达：bcl-2蛋白在C、I/R组有少量表达，光密度测定(MPIAS-1000型多媒体病理图象分析系统)二者无明显差异；在MIP组bcl-2基因蛋白表达明显增多，与I/R组比较(光密度)P<0.01，具有显著性差异。

Bax基因蛋白的表达：bax蛋白在I/R组有大量表达，MIP组bax基因蛋白表达明显减少，与I/R组比较(光密度)P<0.01，具有显著性差异。

Fas基因蛋白的表达：fas蛋白在I/R组有大量表达，MIP组fas基因蛋白表达明显减少，与I/R组比较(光密度)P<0.01，具有显著性差异。

fas基因蛋白的表达：fas基因蛋白在I/R组有大量表达，在MIP组fas基因蛋白表达明显减少，与I/R组比较(光密度)P<0.01，具有显著性差异。

3 讨论

近年来的研究证实，细胞凋亡已成为再灌注损伤发病机制中一个重要环节。通过干预凋亡基因的表达阻断细胞凋亡以减轻再灌注损伤的研究是近年来细胞分子生物学研究的重点之一。心肌细胞凋亡在心脏病理中的作用目前尚不完全清楚。然而对于已严重受损的心肌而言，持续的心肌细胞丢失终将导致心脏功能的进一步恶化。

90年代初的研究显示，I/R可诱发细胞凋亡的发生［4］。近年来研究认为MIP可减少细胞凋亡的发生，可能是MIP对心肌保护作用的机制之一［5］，MIP是通过PKC的信号传递和mitoKATP开放来保护心肌的，而PKC、mitoKATP 与凋亡信号转导途径相关连，从而影响心肌的细胞凋亡［6］。研究显示，MIP减少细胞凋亡的机理可能与影响Fas、Bcl-2等基因［7］ 及减弱胱冬酶原的激活有关［8］。Bcl-2主要表达于线粒体外膜、核膜和内质网膜上，其表达可抑制细胞凋亡，bax表达则促进细胞凋亡。细胞凋亡是一种受促凋亡基因如Fas和抗凋亡基因如bcl-2调控的主动性细胞死亡过程。

实验通过建立Langendorff灌注模型检验了心肌的缺血预处理对未成熟心肌细胞凋亡及bcl-2、bax、fas基因蛋白表达的影响。实验结果发现，MIP使缺血再灌注后未成熟心肌细胞凋亡明显减少，bcl-2基因蛋白的表达明显增多，而bax、fas基因蛋白的表达明显减少，说明在未成熟心肌，MIP可通过影响bcl-2、bax、fas基因蛋白的表达而减少心肌细胞凋亡。

参考文献：

［1］Gavrieli Y,Sherman Y,Ben-Sasson SA. Indentification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation［J］. J Cell Biol ,1992, 119: 493- 501.

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［4］Gottlieb RA, Burleson KO, Kloner RA,et al. Reperfusion injury induces apoptosis in rabbit cardiomyocytes［J］. J Clin Invest, 1994,94:1621-1628.

［5］Wang NP,Bufkin BL,Nakamura M,et al. Ischemic preconditioning reduces neutrophil accumulation and myocardial apoptosis［J］. Ann Thorac Surg,1999, 67: 1689-1695.

［6］Akao M,Ohler A,O'Rourke B,et al.mitochondrial ATP-sensitive potassium channels inhibit apoptosis induced by oxidative stress in cardiac cells［J］.Circ Res,2001,88: 1267- 1275.

［7］Condorelli G,Morisco C,Stassi G,et al.Increased cardiomycyte apoptosis and changes in proapoptotic and antiapoptotic genes bax and bcl-2 during left ventricular adaptation to chronic pressure overload in the rat［J］.Circulation, 1999, 99:3071-3078.

［8］Piot CA,Martini JF,Bui SK,et al.Ischemic preconditioning attenuates ischemia/ reperfusion-induced activation of caspase and subsequent cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase in rat hearts in vivo［J］. Cardiovasc Res,1999,44:536-542.