不同强度+Gz暴露对大鼠心肌细胞凋亡的影响

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作者：郑军，王永春，刘成刚，孙喜庆，石菲，卫晓阳

【关键词】 ＋Gz;心肌/细胞学；细胞凋亡；大鼠

Effects of different +Gz exposure on cardiocyte apoptosis in rats

【Abstract】 AIM: To explore the effects of different +Gz exposure on cardiocyte apoptosis in rats. METHODS: Twelve rats were evenly randomized into 3 groups: control group, ＋6Gz/3 min group and ＋10Gz/3 min group. The rats were respectively killed 6 h after +Gz exposure and the rate of cardiocyte apoptosis was counted after straining with terminal deoxynucleotide transferasemediated dUTP nick end labeling（TUNEL）method. RESULTS: The cardiocyte apoptosis in control group was scarely observed, while it occurred numerously in the +Gz exposure groups. Compared with the control group, the number of cardiocyte apoptosis increased significantly in＋6Gz exposure group（P<0.05）. The number of cardiocyte apoptosis increased significantly in the ＋10Gz/3 min group than that in the ＋6Gz/3 min group and control group（P<0.05）. CONCLUSION: The cardiocyte apoptosis can be induced with +Gz exposure in rats. With the increase of +Gz values, the number of cardiocyte apoptosis increases gradually.

【Keywords】 +Gz; myocardium/cytology; apoptosis; rats

【摘要】目的： 探讨不同强度的持续性正加速度（＋gz）对大鼠心肌细胞凋亡的影响. 方法： 12只SD大鼠随机分为对照组、+6Gz暴露组、+10 Gz暴露组，每组4只，+Gz暴露组分别给予+6Gz和+10Gz负荷刺激3 min，于暴露后6 h取大鼠心肌组织，用原位末端标记法（TUNEL）检测心肌细胞凋亡情况并计数. 结果： 对照组大鼠偶见TUNEL阳性染色的心肌凋亡细胞；＋6Gz暴露组大鼠心肌凋亡细胞数较对照组显著增多（P<0.05）；＋10Gz暴露组大鼠心肌凋亡阳性细胞数较对照组及＋6 Gz组均明显增多（P<0.05）. 结论： ＋Gz暴露可以引起大鼠心肌细胞凋亡，且随着G值的增大，心肌凋亡细胞数目逐渐增多.

【关键词】＋Gz;心肌/细胞学；细胞凋亡；大鼠

0引言

现代高性能战斗机在机动飞行中所产生的正加速度（＋Gz）具有高G值、快增长率、持续时间长并可反复出现等特点，其加速度过载已远远超过飞行员的生理耐受限度，成为威胁飞行安全的主要因素. 在航空飞行中，+Gz几乎对机体各个系统均产生不良影响，尤其是对心脑系统的影响最为明显. 有关+Gz暴露对心脏方面的影响及其机制，以往在整体和器官水平上已做过大量的研究，但有关在＋Gz暴露后，细胞凋亡及其调控因子在心脏病理生理变化中的作用的研究还很少. 本研究通过不同G值的＋Gz暴露后，观察大鼠心肌凋亡细胞的产生情况，以进一步探讨＋Gz暴露致大鼠心肌细胞的损伤机制，为＋Gz暴露对心脏的损伤防护提供理论基础.

1材料和方法

1.1材料 雄性SD大鼠12只(第四军医大学实验动物中心提供)，体质量（225±25）g，随机分为3组，即对照组、+6Gz暴露组、+10Gz暴露组，每组4只.

1.2方法

1.2.1+Gz暴露方式采用动物离心机模拟+Gz暴露. 利用自制的有机玻璃盒(内径15 cm×5 cm×4 cm)承载大鼠，固定于动物离心机上. 大鼠头朝向离心机轴心. 离心机半径为2 m，由计算机进行加速度程序控制. 实验组暴露条件为： G值分别为+6Gz和+10Gz，峰值持续时间为3 min，加速度增长率为1G/s. 对照组仅按上述方法固定3 min，不进行＋Gz暴露. 动物＋Gz暴露后6 h断头法处死，取心肌组织在4%中性甲醛固定、石蜡包埋切片后，置于APES处理的载玻片上.

1.2.2原位末端标记(TUNEL)采用华美生物工程公司检测试剂盒，具体流程：组织切片常规脱蜡至水后,分别经蛋白酶K(20 mg/L), 1 g/L TritonX100溶液、平衡缓冲液处理后，滴加混合反应液37℃孵育60 min，反应液中含末端脱氧核苷酸转移酶(TdT),生物素标记的核苷酸. 再滴加链亲和标记的过氧化物酶37℃孵育30 min，经DAB显色后,苏木素衬染，显微镜下观察并拍照. 以上各步骤间均用0.01 mol/L PBS冲洗3×5 min. 实验中设立不加TdT的阴性对照组. 在10×10倍的光镜视野下，分别对各组切片的TUNEL染色阳性细胞进行计数，计数10个视野，最后取平均值.

统计学处理： 所有实验数据均以x±s表示，采用“SPSS11.0 for Windows”进行方差分析及LSDt检验.

2结果

光镜下可见正常心肌细胞呈长条形（纵切）或近圆形（横切），细胞核呈蓝色. ＋Gz暴露组心肌细胞中可见TUNEL染色阳性细胞散在分布于正常心肌细胞中，细胞核呈棕褐或棕黄色，并可见致密的染色体团块，而心肌细胞形态较正常细胞无明显变化. 对照组大鼠偶见TUNEL阳性染色的心肌凋亡细胞;＋6Gz暴露组大鼠较对照组相比，心肌凋亡细胞数显著增多，有统计学意义（P<0.05）;＋10Gz暴露组大鼠与＋6Gz暴露组及对照组相比，心肌凋亡阳性细胞数增多明显（P<0.05）（图1），各组的心肌凋亡细胞计数见图2.

A：对照组； B：＋6Gz/3 min暴露组；C：＋10Gz/3 min暴露组. 箭头所指为凋亡细胞.

图1＋Gz暴露后大鼠心肌凋亡细胞的变化TUNEL ×100（略）

3讨论

细胞凋亡(apoptosis)是指在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，由基因调控的主动性死亡过程. 细胞凋亡具有独特的形态和生化学特征，首先表现为细胞核的一系列变化，如染色质断裂、聚集、进而固缩、核膜崩解,细胞浆空泡变、固缩,最后形成凋亡小体［1］. 细胞凋亡过程中可出现各种生化改变，其中DNA的片段化断裂及蛋白质的降解尤为重要. 有文献指出，心肌缺血再灌注及心肌压力超负荷均可以引发心肌细胞凋亡［2-3］. 细胞凋亡在疾病及损伤的发生发展过程中起到重要作用.

图2＋Gz暴露后大鼠心肌凋亡细胞记数结果（略）

心脏是机体血液循环的动力泵，高+Gz应激时，机械牵拉、剧烈的血流动力学变化、强烈的应激反应、防护装备和对抗动作对流体静压的影响均可造成心肌的损伤［4］，表现为： ① 心功能异常. 孙喜庆等［5］研究发现，+Gz可使麻醉兔心脏泵血功能显著降低，且随着G值的升高，其变化愈大. +Gz可导致心肌组织ET mRNA上升和eNOS mRNA下降，表明+Gz作用时心血管舒缩功能调节失调［6］. ② 心肌细胞超微结构损伤. Laughlin［7］在电镜下观察到暴露于高+Gz的小型猪心肌可出现心肌断裂和变性，A, I带变模糊,Z带加厚，细胞内、外水肿，线粒体聚集、易位,线粒体内形成结晶，溶酶体破裂等. 郑军等［8］发现高+Gz暴露及中等强度+Gz反复暴露均可造成大鼠心肌超微结构损伤. ③ 心肌代谢异常. 大鼠+Gz暴露后,心肌丙二醛（MDA）增多,超氧化物歧化酶（SOD）活力减弱,Ca2+・Mg2+ATP酶活力减低，引起细胞的氧化应激和氧化损伤,破坏了氧化还原平衡［9］. ④ 自由基代谢异常. 主要导致线粒体氧化损伤，心肌线粒体丙二醛水平和诱生型一氧化氮合酶含量显著增加［10］. 以上研究资料表明急、慢性+Gz暴露均可引起不同程度的心肌超微结构、功能和代谢的异常.

本研究结果表明，在+Gz负荷刺激后，＋6Gz和＋10Gz暴露大鼠心肌均出现TUNEL染色阳性细胞，且增多明显，表明+Gz负荷可致心肌细胞凋亡，并且随着G值的增大，心肌细胞凋亡数目逐渐增多. 分析其原因，可能是与高＋Gz暴露引起的心肌缺血再灌注有关. ＋Gz暴露可以引起左室心肌间质水肿，线粒体变性，血管内皮水肿. +Gz负荷下心率增快，心以上部位血压下降，+Gz终止即刻，心电图ST段抬高并伴心律失常，心血管系统呈缺血再灌注状态［11］. 心肌的缺血再灌注损伤可引起多种细胞因子的分泌. TNFα的产生是心肌对损伤的一种应急反应，Meldrum等［12］发现损伤可导致心脏TNFα水平的升高，TNFα不仅可以单独诱发心肌细胞凋亡,而且能够通过多种途径促进炎性心肌的损伤，加重缺血再灌注所引起的细胞凋亡程度. Pulkki［13］的研究表明ILl在心肌缺血再灌注损伤中，介导了急性炎症反应，导致心肌细胞的坏死和心肌细胞凋亡.

总之，+Gz暴露可以引起心肌细胞的凋亡，且随着G值的增大，凋亡细胞数目呈增多趋势. 本研究初步探讨了＋Gz暴露致大鼠心肌细胞的损伤机制，但在+Gz作用下，有关心肌细胞凋亡的机制是否可作为一种抗过载的措施，尚有待进一步研究.

【参考文献】

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［13］ Pulkki K. Cytokines and cardiomyocyte death［J］. Ann Med, 1997,29(4):339-343.