中国HIV感染长期不进展者相关免疫指标的研究

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【摘要】 目的：研究中国hiv感染长期不进展者(long?term nonprogressors, ltnp)相关免疫指标的变化。方法：采集284例未经抗hiv治疗的ltnp、典型进展的hiv感染者和aids病人及130例hiv抗体阴性健康人的抗凝全血，应用流式细胞仪分析技术对cd8+t淋巴细胞、nk细胞及dc细胞进行测定。结果：ltnp cd8+t淋巴细胞绝对值［（1 104.51±511.81）个/μl］高于aids病人［（678.40±295.39）个/μl，p<0.05］。ltnp nk细胞的绝对值［（377.59±289.23）个/μl］显著高于hiv感染者［（292.49±445.87）个/μl］和aids病人［（153.62±110.36）个/μl，p<0.05］。ltnp cd123+dcs细胞绝对值［（6.76±3.74）个/μl］高于hiv感染者［（5.30±3.16）个/μl］和aids病人［（3.32±2.09）个/μl，p<0.05］。ltnp cd11c+dcs细胞绝对值［（21.73±11.92）个/μl］高于hiv感染者［（14.51±9.53）个/μl］和aids病人［（7.27±3.74）个/μl，p<0.05］。结论：ltnp cd8+t淋巴细胞、nk细胞和dc细胞高于典型进展的hiv感染者和aids病人，是延缓疾病进程的重要因素。

【关键词】 hiv 长期不进展者 cd8+t淋巴细胞 nk细胞 dc细胞

study on immunological examination in hiv long?term nonprogressors

wang ya?nan, diao ying?ying, jiang yong?jun, geng wen?qing, liu jing, zhang min, zhang zi?ning, han xiao?xu, dai di, shang hong.

key laboratory of immunology of aids, ministry of health, the first hospital, china medical university, shenyang 110001, china

［abstract］objective:study on immunological examination in hiv long?term nonprogressors.methods:blood samples from 284 hiv?infected ltnp, typical progressors(hiv and aids patients) and 130 healthy controls were drawn into sterile edta?coated tubes. cd8+t lymphocytes, nk cells and dcs cells were investigated by flow cytometry.results:the cd8+t cells in ltnp［(1 104.51±511.81)cell/μl］ were higher than in aids patients［(678.40±295.39)cell/μl, p<0.05］. nk cells in ltnp［(377.59±289.23)cell/μl］ were higher than in the hiv infected［(292.49±445.87)cell/μl］ and aids patients［(153.62±110.36)cell/μl, p<0.05］. cd123+dcs in ltnp［(6.76±3.74)cell/μl］ were higher than in the hiv infected［(5.30±3.16)cell/μl］ and aids patients［(3.32±2.09)cell/μl, p<0.05］, cd11c+ dcs in ltnp［(21.73±11.92)cell/μl］ were higher than in the hiv infected［(14.51±9.53)cell/μl］ and aids patients［(7.27±3.74)cell/μl, p<0.05］.conclusion:the cd8+t lymphocytes, nk cells and dc cells in chinese ltnp are much higher than those of the hiv typical progressors, which are the important factors in prevention of hiv disease progression.

［key words］ hiv；ltnp；cd8+t lymphocyte；nk cell；dcs

自我国首次发现艾滋病病毒感染者以来，到2005年9月底，全国累计报告艾滋病病毒感染者135 630例，其中艾滋病病人31 143例，累计死亡7 773例，对艾滋病病人的救治已迫在眉睫。然而hiv感染后，不同个体疾病进程呈现明显的不均一性。研究发现大约有5%的hiv感染者病程超过10年以上，未经抗逆转录病毒治疗，cd4+t细胞仍维持正常水平，身体健康，未出现艾滋病指征性症状，称为hiv感染疾病长期不进展者（long?term nonprogressors，ltnps）［1］。对ltnp疾病不进展的机制研究将提示人类天然抗艾滋病病毒的能力，为艾滋病防治工作提供新思路。本文对长期不进展者及典型进展者（hiv感染者和aids病人）进行了cd8+t淋巴细胞、nk细胞、树突状细胞（dendritic cells, dcs）等指标的检测，比较了疾病不同进展程度各指标的变化，为正确运用临床实验室检测指标，判定疾病进展程度和临床疗效奠定坚实基础。

1 材料与方法

1.1 研究对象

由中国医科大学艾滋病研究所及辽宁、吉林和河南省疾病预防与控制中心艾滋病确认实验室用genelab公司蛋白印迹试剂盒确认为hiv抗体阳性的病例284人，其中男性153例，女性131例，平均年龄为42岁（23～68岁）。所有标本均在未接受抗病毒治疗前采集。根据cd4+t细胞数量和感染时间进行分组，cd4+t细胞数量大于或等于500个/μl，未经抗逆转录病毒治疗，无艾滋病指征性症状，感染时间超过10年者为hiv感染疾病长期不进展者（ltnp）；cd4+t细胞数量小于500个/μl，大于或等于200个/μl，无明显艾滋病指征性症状者为hiv感染组；cd4+t细胞数量小于200个/μl为艾滋病组。284例中ltnp 62例、典型进展的hiv感染者165例、艾滋病病人57例。130例hiv抗体阴性健康对照，来自健康体检门诊和实验室工作人员及家属，血液常规及肝肾功能检查结果正常，无免疫系统疾病史。

1.2 cd4绝对值计数

所用仪器和试剂均购自bd公司。将20 μl cd4/cd8/cd3三色单抗加入绝对计数管中，加入50 μl抗凝全血，室温避光15分钟，加入免洗溶血素450 μl，室温避光15分钟，facs calibur流式细胞仪检测，multiset软件自动分析，得到cd4+、cd8+、cd3+淋巴细胞绝对值、百分比及cd4/cd8比值。

1.3 自然杀伤细胞（nk）绝对值计数

所用仪器和试剂均购自bd公司。将20 μl cd3/cd16+cd56/cd45三色单抗加入绝对计数管中，加入50 μl抗凝全血，室温避光15分钟，加入免洗溶血素450 μl，室温避光15分钟，facs calibur流式细胞仪检测，multiset软件自动分析，得到nk细胞绝对值。

1.4 树突状细胞（dc）绝对值计数

所用仪器和试剂均购自bd公司。将20 μl lin1?fitc、10 μl cd123?pe/cd11c?pe及10 μl hla?dr?percp试剂加入绝对计数管中，加入100 μl抗凝全血，震荡混匀，室温避光15分钟，加入免洗溶血素900 μl，室温避光15分钟，应用facs calibur流式细胞仪检测20万个细胞，cellquest软件分析。

1.5 病毒载量测定

bd公司edta?3k负压采血管采集血液，3 000 g离心20分钟，收集血浆冻存于-70℃冰箱。采用rt?pcr方法，用瑞士roche公司的cobas amplicor自动载量仪及相应试剂测定病毒载量。

1.6 统计学分析

所有数据使用spss 11.0软件进行方差分析或pearson相关性分析。

2 结果

2.1 cd8+t淋巴细胞研究

对ltnp、hiv感染者、aids病人及健康对照同时进行了cd8+t淋巴细胞百分比、绝对数量的测定，结果表明，cd8+t淋巴细胞百分比在健康对照（40.72%±10.48%）、ltnp（57.35%±11.60%）、hiv感染者（68.65%±11.11%）和aids病人（81.62%±7.15%）各组逐渐升高，且它们之间有显著差别（p<0.05），见图1。cd8+t淋巴细胞绝对值在ltnp［（1 104.51±511.81）个/μl］、hiv感染者［（1 038.85±562.53）个/μl］、aids病人［（678.40±295.39）个/μl］各组逐渐降低，且ltnp和hiv感染者均显著高于aids病人和健康对照［（660.44±290.10）个/μl，p<0.05］，但ltnp和hiv感染者之间（p=0.639）、aids病人和健康对照之间（p=1.000）均无显著差别，见图1。

2.2 nk细胞研究

对ltnp、hiv感染者、aids病人及健康对照进行了nk细胞绝对数量测定，结果表明，nk细胞绝对值在各组间逐渐降低，依次为健康对照［（407.22±222.96）个/μl］、ltnp［（377.59±289.23）个/μl］、hiv感染者［（292.49±445.87）个/μl］和aids病人［（153.62±110.36）个/μl］，但健康对照与ltnp之间无显著差异（p=0.193），其它各组差异显著（p<0.05），见图2。nk细胞绝对值与cd4+t淋巴细胞绝对数量明显呈正相关(r=0.383, p<0.01)，与病毒载量呈负相关(r=-0.198, p<0.01)。

2.3 dc细胞研究

对ltnp、hiv感染者、aids病人及健康对照的cd123+dcs细胞进行了测定，结果表明，cd123+dcs细胞的绝对值在各组间逐渐降低，依次为健康对照［（7.93±3.14）个/μl］、ltnp［（6.76±3.74）个/μl］、hiv感染者［（5.30±3.16）个/μl］和aids病人［（3.32±2.09）个/μl］，健康对照和ltnp明显高于hiv感染者、aids病人，而健康对照和ltnp之间无明显差别（p=0.194），见图3。cd123+dcs细胞绝对值与cd4+t淋巴细胞绝对数量明显呈正相关(r=0.389, p<0.01)，与病毒载量呈负相关(r=-0.228, p<0.01)。cd11c+dcs细胞绝对值在各组间逐渐降低，依次为ltnp［（21.73±11.92）个/μl］、健康对照［（16.53±2.60）个/μl］、hiv感染者［（14.51±9.53）个/μl］和aids病人［（7.27±3.74）个/μl］，见图3。健康对照和ltnp明显高于hiv感染者、aids病人，而健康对照和ltnp之间无明显差别（p=0.928）。cd11c+dcs细胞绝对值与cd4+t淋巴细胞绝对数量明显呈正相关(r=0.521, p<0.01)，与病毒载量呈负相关(r=-0.197, p<0.01)。

3 讨论

对ltnp疾病长期不进展的机制研究是揭示人类天然抗hiv的机制重要途径,为艾滋病治疗和疫苗研究提供有力手段，是目前世界艾滋病研究领域的热点之一。

cd8+t淋巴细胞是特异性细胞免疫的效应细胞,通过分泌各种细胞因子,杀死被病毒感染的靶细胞，它是机体抗hiv病毒最主要的免疫细胞［2］。本研究表明，ltnp和hiv感染者体内的cd8+t淋巴细胞的数量远高于aids病人和健康对照，且ltnp的均值略高于hiv感染者，这说明ltnp体内cd8+t淋巴细胞能够发挥细胞毒作用杀灭病毒，是疾病进展缓慢的原因之一。而ltnp组cd8+t淋巴细胞的百分比低于hiv感染者和aids病人，cd8+t淋巴细胞的百分比随着疾病进展逐渐上升，这可能是因为cd4+t淋巴细胞由于凋亡等多种因素的影响造成数量减少，所以尽管aids病人体内cd8+t淋巴细胞的数量也在下降，但相对于cd4+t淋巴细胞其数量减少的程度小，因而百分比增加。

nk细胞是天然免疫系统中的重要细胞, 它能补充cd8+t淋巴细胞的杀伤作用［3，4］。国外学者们对hiv感染后nk细胞的变化进行了一些初步的研究，但到目前为止,nk细胞数量和功能在hiv感染者/aids病人体内的变化尚处于争论中［5?7］。本文通过对284例ltnp、hiv感染者和aids病人的研究表明，nk细胞的数量与cd4+t淋巴细胞呈正相关，ltnp体内的nk细胞高于hiv感染者和aids病人,这说明nk细胞杀伤作用亦是延缓疾病进展的可能机制之一。

dc细胞是免疫系统中抗原提呈细胞，能刺激初始t细胞（naive t cells）增殖，启动初次t细胞免疫应答，在先天性免疫和获得性免疫过程中均有重要作用［8，9］。最近国外有研究报道hiv感染者dc数量减少，功能受损。但亦有学者报道hiv感染后dc数量和功能均不受影响,其中cd123+dcs是人体内产生ifn?α的主要细胞，在控制hiv感染中可能发挥重要作用［9?14］。通过我们大量的实验数据表明，ltnp体内的dc细胞高于hiv感染者和aids病人，可能与疾病进程相关。

总之，我们实验数据表明，ltnp cd8+t淋巴细胞、nk细胞和dc细胞高于hiv感染者和艾滋病病人，与cd4+t淋巴细胞呈正相关，与病毒载量呈负相关，故与延缓疾病病程相关,因此，定期监测这些指标可以作为临床分期和疾病进展的重要指标。

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