青蒿组分的体外抗氧化活性研究

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[摘要] 目的 研究青蒿水提取物抗氧化活性及物质基础，为天然抗氧化剂开发利用提供理论依据。 方法 采用传统加热回流提取法，用水作为提取溶剂对青蒿中抗氧化成分进行提取，并利用溶剂萃取、D101大孔树脂等分离手段对水提取物进行组分划分，进行DPPH自由基清除活性评价及铁离子还原能力、亚铁离子螯合能力、总酚酸和总黄酮的测定。 结果 从青蒿水提取物中制备得到11个组分，且70%乙醇洗脱液（S10）、乙酸乙酯萃取物（S6）、大孔树脂20%乙醇洗脱液（S9）的抗氧化活性较高，与其所含的总酚酸和总黄酮密切相关。 结论 本研究明确了青蒿中大孔树脂70%乙醇洗脱液（S10）、乙酸乙酯萃取物（S6）、大孔树脂20%乙醇洗脱液（S9）为青蒿水提取物抗氧化活性物质基础，为今后青蒿资源在天然抗氧化剂的开发和应用奠定基础。

[关键词] 青蒿；抗氧化活性；DPPH法；总黄酮；总酚酸

[中图分类号] R646[文献标识码] A[文章编号] 1673-7210（2014）05（b）-0004-05

Study on antioxidant of Artemisia annua L. Fraction in vitro

MA Wenfang1 GUO Xinrong1 YU Xiu1 LI Jin1 WANG Chunpeng1 WANG Zhenzhong2 CHENG Zhidong2CHANG Yanxu1,2 XIAO Wei2

1.Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese MedicineTianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China; 2.Postdoctoral Workstation, Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co., Ltd., Jiangsu Province, Lianyungang222001, China

[Abstract] Objective To screen antioxidant from the water extracts of A. annua L. for providing the theoretical basis for the development and application of natural antioxidants. Methods A. annua L.were extracted with water by conventional heating reflux extraction. Water extracts were separated by means of solvent extraction, D101 macroporous resin. The radical scavenging activity of fractions was evaluated by DPPH, reducing power and metal chelating capacity assay. Total phenolic and total flavonoids of antioxidant fractions were determinated. Results 11 fractions were obtained from A. annua L. Antioxidant activity of 70% ethanol eluate from macroporous resin (S10), ethyl acetate extract (S6), 20% ethanol eluate from macroporous resin (S9) fractions was higher and was highly correlated with total phenolic and total flavonoid content. Conclusion It is demonstrated that 70% ethanol eluate from macroporous resin (S10), ethyl acetate extract (S6), 20% ethanol eluate from macroporous resin (S9) are material basis for antioxidant activity of water extract from A. annua L., which can lay the foundation for resources of A. annua L. in the development and application of natural antioxidants

[Key words] Artemisia annua L.; Antioxidant activity; DPPH assay; Total phenolic acids; Total flavonoid

随着自由基生物学深入发展，人们逐渐认识到，自由基会对人体的产生一定的负面影响，而适当补充外源性抗氧化剂或给予能促使机体内源性抗氧化物质恢复到一定水平的药物，可以改善这一状况[1]。抗氧化剂是指在低浓度下能有效延缓或阻止底物（蛋白质、脂质、糖和DNA）氧化的物质[2]。目前抗氧化剂依据其来源可分为两大类：化学合成抗氧化剂和天然抗氧化剂。现代研究表明化学合成的抗氧化剂，如二丁基羟基甲苯（BHT）、丁基羟基茴香醚（BHA）、没食子酸丙酯（PG）和特丁基对苯二酚（TBHQ）具有一定的毒性和致癌作用，其应用范围受到一定的限制，而天然抗氧化剂因其具有无毒副作用、无残留、无污染、稳定、安全等优点，符合人们对健康、安全新需求，而越来越受到人们的关注。天然抗氧化剂的研究在医药学、保健与功能食品、美容养颜护肤等领域均有非常重要的意义[3]。

现代研究表明某些中药具有明显的抗氧化活性，并与其所含各种各样的天然产物，如酚酸、黄酮类化合物和丹宁酸等密切相关。近年来，中药的抗氧化活性受到研究者的关注，取得了许多研究成果[4-6]。因此，中药资源可作为高效的天然抗氧化剂筛选的一个重要来源。

青蒿（黄花蒿，Artemisia annua L.）为菊科蒿属（Arte misia）一年生草本植物[7]。味苦，性寒而芳香，入肝、胆经。本品苦寒以清热，芳香而透散，长于清泄肝胆和血分之热，可使阴分伏热由阴分透出阳分。常用治暑邪发热、温邪伤阴发热、疟疾寒热、骨蒸劳热以及血分有热的风疹瘙痒等症[8]。

目前对青蒿中抗氧化活性的研究不多，仅有少量文献对青蒿中水提取物、黄酮类化合物的抗氧化进行报道，而有关青蒿中的抗氧化活性物质基础的未见报道。本研究拟根据青蒿的传统提取方法，利用溶剂萃取、D101大孔树脂等分离手段对水提取物进行组分划分，并进行DPPH自由基清除活性评价，明确青蒿抗氧化活性组分，拟为从青蒿筛选天然抗氧化剂提供实验参考依据，为今后青蒿资源在天然抗氧化剂的开发和应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

1.1.1 仪器

RE-5205/RE-52A旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；TDL-5-B型台式低速离心机（湖南星科科学仪器有限公司）；电热真空干燥箱（天津市天宇实验仪器有限公司）；BP121S万分之一天平（德国赛托利斯公司）；XW-80A微型漩涡混合仪（上海沪西仪器厂有限公司）；KQ-250E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；MODEL2-16A高速离心机（TOMOS）；202-0型台式干燥箱（北京市永光明医疗仪器厂）；多功能微孔板分析仪（美国Molecular Devices 公司）。

1.1.2 试剂与药材

1.1.2.1 试剂D101型大孔吸附树脂（天津市海光化工有限公司）；甲醇，乙腈为色谱纯（天津康科德有限公司）；芦丁，没食子酸（中国药品生物制品检定所）；DPPH（Sigma-aldrich）；甲酸（TEDIA Company，USA）水为超纯水（Millipone），其余试剂均为分析纯。

1.1.2.2 药材青蒿（江苏康源股份有限公司青蒿基地）。

1.2 实验方法

1.2.1 青蒿组分的制备

称取青蒿饮片0.5 kg，置于10 L圆底烧瓶中，加6 L蒸馏水，浸泡12 h，加热回流2 h，滤过，剩余残渣加入4 L蒸馏水，加热回流2 h，滤过，合并滤液，60℃减压浓缩至700 mL，取50 mL母液作为S1，剩余母液70%醇沉，静置12 h。醇沉溶液14 000 r/min，离心10 min，得沉淀S2和上清液，上清液于60℃减压浓缩至400 mL，取50 mL作为S3。剩余溶液用等体积石油醚萃取，得石油醚萃取物S4，取剩余溶液50 mL作为S5，然后剩余溶液用等体积乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取物S6，取剩余溶液50 mL作为S6。过D101大孔树脂，分别用两个柱体积的蒸馏水，20%乙醇，70%乙醇，95%乙醇进行洗脱，得S8~S11。将S8~S11置于水浴锅上挥干，然后放入60℃真空干燥箱中干燥约8 h，至恒重取出，称量。

1.2.2 青蒿组分清除DPPH自由基活性研究

二苯基苦味肼基自由基[DPPH・]是一种稳定的以氮为中心的自由基，在517 nm波长处有最大吸收。[DPPH・]醇溶液呈紫色，其浓度与吸光度呈线性关系。在[DPPH・]乙醇溶液中加入样品后，样品可以与[DPPH・]结合或发生替代，使[DPPH・]数量减少，溶液颜色变浅，表现为：其在517 nm波长处的吸光度不断减小，直至达到稳定[9]。清除率计算公式为：K=[1-（A1-A2）/Ao]×100%，其中Ao为空白对照液的吸光度，A1为加入待测液后的吸光度，A2为待测液的本底吸收值。抗氧化剂清除自由基能力采用清除DPPH的半清除率（IC50值）表示[10-11]。所需浓度越低，表明半清除率越高，抗氧化剂的自由基清除能力越强。本实验用比色法测定青蒿各组分的总体抗氧化能力，以VC、VE为阳性对照药物，平行测定3次，取平均值。

称取适量青蒿组分S1~S11和VC、VE用适宜溶剂溶解配制成1 mg/mL后，按一定浓度配制后，分别取400 μL放于eppendorf管中，加入400 μL的100 μg/mL DPPH，涡旋30 s，在室温下放置30 min后，吸取200 μL于96孔板。每个浓度平行制备3份，于微型多功能酶标仪517 nm下测定，VC和VE作为阳性对照[12]，并以VC、VE的浓度（X）为横坐标，抑制率（Y）为纵坐标，绘制VC、VE的标准曲线，计算回归方程，利用回归方程求出供试品溶液中折合VC、VE的浓度（总抗氧化活性），并计算青蒿组分中总抗氧化活性的含量。每个样品平行制备3份，每次平行测定3个复孔，取平均值。其中总抗氧化活性的含量包括相对总抗氧化活性的含量和绝对总抗氧化活性的含量。

青蒿组分抗氧化剂含量（mg/g）=CD/W，其中W为青蒿组分S1～S11的重量（g），C为供试品溶液中折合VC、VE的浓度（mg/mL），D为稀释因素。青蒿组分等价于原药材的抗氧化剂总量（mg/kg）=CDE/W，其中W为青蒿组分S1～S11的重量（kg），C为供试品溶液中折合VC、VE的浓度（mg/mL），D为稀释因素，E为产率。

1.2.3青蒿组分铁离子还原能力评价

精密称取各样品1 mg，加入甲醇和水混合溶剂溶解，分别取0.2 mL样品溶液，加入1 mL磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH 6.6），和1 mL铁氰化钾（1%，W/V），混合均匀后在50℃水浴放置20 min，加入1 mL三氯乙酸（10%，W/V）混合后，取上清液1 mL加入1 mL水，加入0.2 mL的氯化铁溶液（0.1%，W/V），30 min后，在700 nm下紫外检测，以没食子酸值计算。

1.2.4 青蒿组分亚铁离子螯合能力评价

1 mL FeSO4（0.025 mmol/L）加入不同稀释倍数的样品溶液1 mL，接着加入1 mL Ferrozine（0.25 mmol/L），10 min后在562 nm下紫外检测，以甲醇-水溶剂代替样品为对照。螯合效率=（1-Asample/Acontrol）×100，以EC50（CEC50）表达。

1.2.5 青蒿提取物总酚酸和总黄酮的含量测定

1.2.5.1 青蒿提取物总酚酸的含量测定分别精密吸取不同体积的没食子酸对照品溶液，用甲醇稀释到200、100、50、20、10、5、1 μg/mL，分别取对照品溶液100 μL加入500 μL FCR（1∶10，V/V），涡旋30 s，加入400 μL的Na2CO3（7.5%，M/V），30℃反应90 min后，吸取200 μL于96孔板中。每个浓度平行制备3份，于微型多功能酶标仪765 nm下测定，以待测液的本底溶液为空白对照[13]。以对照品的浓度（X）为横坐标，吸光度（Y）为纵坐标，绘制没食子酸的标准曲线，计算回归方程。

分别取100 μL供试品溶液加入500 μL FCR （1℃10，V/V），涡旋30 s，接着加入400 μL Na2CO3 （7.5%，M/V），30℃反应90 min后，吸取200 μL于96孔板中，每个样品平行制备3份，每次平行测定3个复孔，取平均值。按没食子酸标准曲线制作方法测定其吸光度，利用回归方程求出供试品溶液中折合没食子酸的浓度（总酚酸），并计算青蒿组分中总酚酸的含量。计算公式：总酚酸含量（%）=CD/W×100%，其中W为青蒿组分S1~S11的重量（g），C为供试品溶液中折合没食子酸的浓度（mg/mL），D为稀释因素。

1.2.5.2 青蒿提取物总黄酮的含量测定分别精密吸取不同体积的芦丁对照品溶液，用甲醇稀释成80、70、60、50、40、30、20、10、5 μg/mL。分别取1 mL于eppendorf管中，加入100 μL的NaNO2（5%），静置6 min后，加入100 μL的AlCl3（10%），静置6 min，然后加入1 L的NaOH（5%），混合均匀，吸取200 μL于96孔板中，每个浓度平行制备3份。用微型多功能酶标仪全波长扫描，于415 nm下测定，以待测液的本底溶液为空白对照[14]。以对照品的浓度（X）为横坐标，吸光度（Y）为纵坐标，绘制芦丁的标准曲线，计算回归方程。

精密称取青蒿组分S1～S11，用适宜溶剂溶解配制成1 mg/mL（S4，S6组分样品用甲醇溶解，其余组分样品用40%甲醇溶解），作为供试品溶液。分别取500 μL，加入50 μL的NaNO2（5%），静置6 min后，加入50 μL的AlCl3（10%），静置6 min，然后加入500 μL的NaOH（5%），混合均匀，吸取200 μL于96孔板中，每个样品平行制备3份，每次平行测定3个复孔，取平均值。按芦丁标准曲线制作方法测定其吸光度，利用回归方程求出供试品溶液中折合芦丁的浓度（总黄酮），并计算青蒿组分中总黄酮的含量。计算公式：总黄酮含量（%）=CD/W×100%，其中W为青蒿组分S1～S11的重量（g），C为供试品溶液中折合黄酮的浓度（mg/mL），D为稀释因素。

2 结果

2.1 青蒿组分的得率

通过提取分离所得的S1～S11个组分的产率分别为20.16%、4.12%、15.33%、0.14%、14.00%、1.25%、12.29%、8.51% 1.02%、1.96%和0.02%。

2.2 青蒿组分抗氧化活性比较研究

2.2.1 青蒿组分清除DPPH自由基的能力比较研究

采用DPPH法对青蒿不同组分进行了测定，结果显示各组分均具有一定的抗氧化作用。以VC和VE作为阳性对照，IC50为指标，对不同青蒿组分的抗氧化活性进行比较研究（表1）。结果发现：11个组分清除DPPH自由基能力排序为：S10>S6>S9>S1>S3>S2>S11>S7>S5>S8>S4；当以IC50≤100 μg/mL为临界值，所制备的组分S6[（72.40±1.11）μg/mL]、S9[（84.85±0.50）μg/mL]和S10[（58.37±0.85）μg/mL]具有较强的抗氧化活性，但均低于阳性对照物VC、VE。

表1 青蒿组分与VC、VE的IC50值（μg/mL，x±s，n=3）

2.2.2 青蒿组分抗氧化活性物质含量比较研究

本研究以VC、VE为阳性对照药物，建立了量效关系曲线，结果发现在1～13 μg/mL、15～45 μg/mL范围，VC、VE的浓度与各自抑制率呈良好的线性关系，回归方程分别为Y=4.525X-6.299（r=0.996），Y=1.500X-0.137（r=0.999）。根据各组分的抑制率，以等价的VC、VE的量为指标，对其所含抗氧化剂含量进行了测定结果见表2。从表2可知1 g S6、S9和S10提取物分别等价于（144.92±2.60）、（111.32±0.33）、（163.91±4.20）mg的VC，相当于（515.19±7.83）、（389.44±1.00）和（580.27±12.70）mg的VE，因此青蒿组分S6、S9和S10具有较好的抗氧化活性，可用于进一步天然抗氧化剂筛选。

表2 青蒿组分中抗氧化活性物质的含量（mg/g，x±s）

2.3 青蒿组分铁离子还原能力的评价

不同浓度的青蒿组分铁离子还原能力评价结果见表3，S10、S9和S6具有较强的还原能力，其中组分S10和S6的活性优于人工合成的抗氧化剂二丁基羟基甲苯（BHT）的活性。

表3 青蒿组分还原能力（x±s，n=3）

2.4 青蒿组分亚铁离子螯合能力

以VC作为阳性对照，IC50为指标，对不同青蒿组分的亚铁离子螯合能力进行比较研究（表4）。表4发现：10个组分亚铁离子螯合能力排序为：S2>S8>S1>S7>S9>S4>S3>S10>S5>S6>S4；当以IC50≤1000 μg/mL为临界值，所制备的组分S2、S1和S8具有较强的亚铁离子螯合能力，但均高于阳性对照物Vc。

表4 青蒿组分的亚铁离子螯合能力（μg/mL，x±s，n=3）

2.5 青蒿组分抗氧化活性相关物质研究

近年来的研究表明，植物抗氧化活性与植物中所含酚酸类和黄酮类化合物密切相关，为了阐明青蒿发挥抗氧化活性物质基础，本研究选用福林试剂法测定总酚酸含量，三氯化铝比色法测定总黄酮含量。

2.5.1 总酚酸含量测定

本研究以没食子酸为阳性对照，建立了没食子酸的标准曲线，结果表明在1～200 μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系，回归方程为y=0.0016x-0.0005（r=0.999）。

利用福林试剂法对S1～S11的总酚酸含量进行了测定（表5），结果表明11个组分中中均含有一定量的酚酸，其中S10[（90.51±0.02）mg/g]、S6[（83.47±0.60）mg/g]和S9[（81.81±0.80）mg/g]的酚酸含量最高，与其抗氧化活性IC50具有较好的相关性。

2.5.2总黄酮测定

本研究以芦丁为阳性对照，建立了芦丁的标准曲线，结果表明在1～80 μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系，回归方程为y=0.0062x-0.0108（r=0.999）。利用三氯化铝比色法对S1～S11的总黄酮含量进行了测定（表5），结果表明11个组分中中均含有一定量的黄酮，其中S10[（73.72±0.77）mg/g]、S6[（53.85±0.30）mg/g]和S9[（69.76±1.13）mg/g]的总黄酮含量最高，并与其抗氧化活性IC50具有较好的相关性。

表5 青蒿中11个组分的总酚酸含量和总黄酮含量（mg/g，x±s，n=3）

上述研究表明，青蒿各组分具有抗氧化活性，其中组分S10、S6和S9抗氧化活性最强，其发挥抗氧化的物质基础可能是其酚酸和黄酮类化合物。

3 讨论

从青蒿水提取物中制备得到11个组分，利用DPPH法、还原能力法与亚铁离子螯合法对青蒿组分的抗氧化活性进行测定，且使用福林试剂法与三氯化铝比色法对其总酚酸和总黄酮进行了定量研究，发现了青蒿中70%乙醇大孔树脂洗脱液（S10）、乙酸乙酯萃取物（S6）、20%乙醇大孔树脂洗脱液（S9）具有较强的抗氧化活性。青蒿不同组分抗氧化能力的强弱与总酚酸和总黄酮的含量有明显相关性，说明酚酸和黄酮可能是主要的活性物质；青蒿水溶液（S1），青蒿多糖组分（S2）和大孔树脂水洗脱物（S8）具有较强的亚铁离子螯合能力，在亚铁离子的螯合能力方面却显著高于其他组分。本研究制备了青蒿不同标准组分，结合此多种方法对青蒿组分的抗氧化活性进行了较为全面的评价，初步阐明了各组分的抗氧化活性，为青蒿作为天然抗氧化剂资源开发利用提供科学依据。

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（收稿日期：2014-01-26本文编辑：卫轲）

[基金项目] 国家科技重大专项课题（编号2010ZX09502-005）；中国博士后科学基金资助项目（编号2012T50225）。

[作者简介] 马文芳（1988-），女，天津中医药大学2011级中药学专业在读硕士研究生，从事中药药效物质基础研究。

[通讯作者] 常艳旭（1981.12-），男，博士，副研究员，主要从事中药药效物质基础及质量标准研究。萧伟，博士，研究员，高级工程师，从事中药新剂型的研究与开发。

・编读往来・

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1.着重讨论研究结果的创新之处及从中导出的结论，包括理论意义、实际应用价值、局限性，及其对进一步研究的启示等。如果不能导出结论，也可通过讨论，提出建议、设想、改进意见或待解决的问题等。

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