非核素标记检测端粒酶活性的研究

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Kim［1］于1994年借助PCR技术建立了灵敏的端粒酶检测方法——端粒重复片段扩增(telomerase repeat amplification protocol，TRAP)。我们对Kim的方法加以改进，建立了简便、非同位素的银染检测法，检测了脑瘤、肠癌、食管癌中端粒酶的活性。

一、材料与方法

1.总蛋白提取：手术后取下的活组织，液氮保存。(1)100 ml提取液中含10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)；1 mmol/L MgCl2；1 mmol/L EGTA,0.5 mmol/L β-巯基乙醇；0.5% CHAPS，体积分数为10%的甘油。(2)组织中提取总蛋白：取约30 mg组织用无菌眼科手术剪尽量剪碎，加入200 μl提取液，冰浴30 min后，4 ℃ 1 600 g离心20 min。吸取上清约150 μl待测。

2.TRAP反应：(1)引物及稀释：RNA模板逆转录引物TS：5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′18mer，MW=5 524，浓度为0.541 g/L。PCR引物CX：5′-CCTTACCCTTACCCTTACCC

TAA3′24mer,MW=7 104,浓度为0.688 g/L。(2)PCR扩增：①将Kim［1］的方法改进为：50 μl PCR液含20 mmol/L Tris-HCl (pH8.3);1.5 mmol/L MgCl2;63 mmol/L KCl;0.005%Tween-20;1 mmol/L EGTA;200 μmmol/L dNTP;0.1 μgT4 g32 蛋白;0.1 μg/L牛血清白蛋白;0.1 μg TS引物;2 U Taqase;0.5～1.0 mg总蛋白。②25℃ 20 min，加入0.1 μg CX引物。③94℃预变性5 min，94℃30 s50℃ s72℃90 s 30个循坏，72℃延伸10 min。

3.电泳:12%非变性聚丙烯酰胺凝胶，取10 μl PCR产物，加2 μl 6×Lodding buffer,150 V恒压2 h。

4.银染:(1)固定：胶在10%冰乙酸中，洗1次。(2)银染：0.2%AgNO3 300 ml，加入0.5 ml甲醛，染色10 min，洗1次。(3)显色：3%Na2CO3 300 ml,加甲醛0.5 ml，显色至清晰。(4)终止：10%冰乙酸300 ml，终止显色。

二、结果

用非核素TRAP-银染端粒酶活性检测法分析45例手术标本，脑肿瘤阳性率为70.58%(12/17)，肠癌阳性率为84.62%(11/13)，食管癌阳性率为90%(9/10)，食管癌旁组织阳性率为90%(4/5)，用2种方法对15例标本对比检测，TRAP-ELISA法检出9例阳性，TRAP-银染法检出9例阳性 ，结果一致。

三、讨论

端粒酶活性检测常用Kim［1］的TRAP法，在PCR过程中掺入同位素标记α-32P dGTP/dCTP，产物聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影显示相差6个核苷酸的DNA ladder条带，以判断端粒酶活性。该方法敏感，已被国际上多家实验室采用，但由于应用核素，造成检测周期长(约7周)，污染环境，要求有特殊而专一的实验室，使其 广泛应用受到限制。为此，我们对Kim［1］的方法进行改进，建立了不需加入核素，直接进行RT-PCR扩增，产物电泳后硝酸银染色，显示DNA梯状电泳带的方法。同时应用保灵曼公司的TRAP-ELISA端粒酶活性半定量法，对照检测。两种方法对比检测结果一致。说明我们的方法同样敏感、准确，且简便易推广。

端粒是真核细胞染色体末端的“帽子”，由多拷贝串联的6核苷酸5′TTAGGG3′重复序列和特异蛋白质结合构成，具有维持染色体末端稳定和遗传信息不丢失的功能。按照DNA复制模型，DNA复制1次，母链5′端就有1段DNA无法拷贝到子链中去，将造成DNA链愈来愈短，遗传信息丢失。真核生物线性DNA分子靠末端6核苷酸多拷贝序列(既端粒)和端粒酶的激活，保证遗传信息复制时的完全性。细胞生命周期有限 ，染色体端粒随细胞的分裂不断丢失，当端粒长度减小到一定临界值(2～4 kb)时，细胞即趋向衰老、死亡。端粒被认为是细胞有丝分裂的“生物钟”［2］。有报道癌细胞和培养的永生化细胞有较短的端粒长度和较强的端粒酶活性，正常体细胞检测不到端粒酶活性，而生殖细胞、胚胎细胞有端粒酶表达，可见端粒酶催化合成端粒的重复片段添加到端粒，对维持细胞端粒的动态平衡、保证细胞的分裂能力起重要作用［3，4］。我们检测17例脑肿瘤中有13例脑胶质瘤、10例端粒酶阳性，其中恶性程度低的星形细胞瘤Ⅱ级标本中端粒酶阳性率为40%(2/5)，而低分化的恶性星形细胞瘤Ⅲ和Ⅳ级端粒酶阳性率为100%(8/8)，经χ2检验二者差异有显著性(P＜0.05)。同样，13例肠癌标本中，高分化腺癌Ⅰ级阳性率为60%(3/5)，低分化腺癌Ⅱ级阳性率为100%(8/8)，说明随肿瘤恶性程度升高，其端粒酶活性表达率升高，对判断肿瘤恶性程度及预后有重要意义。

参考文献

［1］Kim NW. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994,266:2011-2015.

［2］Harley CB.Telomere loss:mitotic clock or genetic time bomb Mutat Res,1996,256:271-282.

［3］Counter CM,Hirter HW,Bacchetli S.Telomerase activity in human ovarian carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A， 1994,91:2900-2904.

［4］Klingelhutz AJ.Telomerase activation and cancer. J Mol Med, 1997,75:45-49.