孕期糖尿病老鼠模拟发展研讨

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本文作者：李鑫 杨慧霞 单位：北京大学第一医院妇产科

随着人民生活水平的提高，全球每年约7%的妊娠妇女患有妊娠糖尿病(gestationaldiabetesmellitus，GDM)。GDM是指妊娠期发生的不同程度的糖耐量异常，占妊娠合并糖尿病的80%～90%［1］。GDM最早出现于20世纪70年代初的医学文献中，1979年世界卫生组织(WorldHealthOrganiza-tion，WHO)将GDM列为糖尿病的一个独立类型。GDM不仅会引起孕妇出现一系列代谢紊乱，也会造成胎儿、新生儿生长发育异常，甚至可对子代在儿童期、青春期以及成年时产生远期影响。人类流行病学和动物实验研究表明，母亲孕期出现的高血糖可能增加子代在成年期患肥胖、糖耐量异常和2型糖尿病的危险性。如今GDM的防治已成为产科和内分泌工作者的一个重要课题，理想动物模型的建立无疑能为深入地研究其病因、治疗方法及新药的评价提供良好的基础和平台。实验常用动物模型大致分为自发性动物模型(spontaneityanimalmod-els)和诱发性或实验性动物模型(experimentalanimalmod-els)。自发性动物模型在某些疾病中(如高血压、肿瘤等)发病机制与人类疾病更为接近，且减少了人为因素，是较理想的动物模型，但此类动物价格昂贵，数量也极其有限。实验性动物模型指研究者通过使用物理、化学和生物致病因素作用于动物，造成其组织、器官乃至全身发生一定的损伤，出现某些类似人类疾病时的功能、代谢或毒副作用。该类动物模型具有能在短时间内复制出大量疾病模型，并能严格控制各种条件使复制出的疾病模型适合研究目的需要等特点，因而为近代医学研究所常用。国内外的学者对此做了大量的探索和研究，方法虽不尽相同，但各种实验性GDM模型均在一定程度上反映了人类的发病特点及对子代的不良影响。实验涉及到的动物包括犬、羊、猪、灵长类动物以及啮齿类动物［2］。鉴于实验性大鼠模型在糖尿病(diabetesmellitus，DM)相关研究中的广泛应用，参考资料丰富，并且具有孕期适中(21天)的特点，成熟期和生长期短，适合在此时期内观察孕期高血糖对胚胎及成熟个体的影响，故诱发性或实验性大鼠模型被广泛应用于GDM的相关研究中，本文将对此类研究现状及成果做一简要综述。复制符合人类GDM发病特点的动物模型，首先应在机制上搞清其基本病理机制和临床特点。一般认为，妊娠期糖尿病以孕期高血糖为主要临床特点，增加的胎盘血糖和其他营养物质的转运导致胎儿、新生儿出现过度生长发育和胎儿宫内生长发育受限等胎儿发育异常情况［3］。Reece等［4］应用DNA阵列分析观察大鼠孕早期高血糖对子代卵黄囊细胞基因表达的影响，研究发现，共105个基因表达发生改变，其中包括与胰岛素信号通路、代谢、应激相关的基因。研究表明，严重胰岛素抵抗、体脂含量增加、胰岛β细胞分泌胰岛素功能障碍和遗传易感性是发生GDM的主要临床特点，妊娠期胰岛素抵抗是GDM发病的主要原因［5］。当前国内外研究中，实验性GDM大鼠模型的诱导主要有3种方法:化学药物诱导、饮食诱导和手术诱导。

1化学药物诱导

1．1链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)STZ是一种含亚硝基化合物的广谱抗菌素，具有致糖尿病的副作用，对胰岛β细胞具有高度选择性毒性作用。已有研究表明，STZ致DM的机制主要有以下两点:(1)STZ的分子结构有一个高度活性的葡萄糖侧链，使胰岛β细胞对其进行错误性识别，并进入细胞内，产生氧自由基破坏β细胞结构，导致细胞的损伤及坏死，从而阻碍胰岛素的分泌，使血清胰岛素水平降低;(2)小剂量STZ注射可破坏少量胰岛细胞，死亡胰岛细胞作为自身抗原，再次递呈给抗原递呈细胞进行处理，释放炎症细胞因子，放大细胞损伤效应，最终导致胰岛素依赖型DM形成。自1963年Rakieten等［6］首次报告STZ的致DM作用以来，国内外诸多学者开始利用不同剂量STZ复制DM动物模型，直到现在该方法仍广泛用于DM相关动物研究中［7］。国内外应用STZ制造DM模型的剂量及相关条件不尽相同，成功率及重复率并不是很高，而GDM模型由于增加了胚胎因素，使诱导方式、血糖水平、实验时间、死亡率及成活率等各种条件受到了很大的限制，为宫内高血糖对子代的近期和远期影响的研究造成了一定的困难。一般认为，STZ合适剂量的选择是建模的关键所在，过高的剂量必然引起胰岛破坏和血糖急剧升高。血糖20mmol/L以上使母体从尿中丢失大量糖，必然动用脂肪及蛋白，母体处于严重的耗竭状态，导致胎儿宫内生长受限。还有研究者采用40mg/kgSTZ对大鼠进行尾静脉注射，待其血糖升高超过20mmol/L后，再使之受孕，用以观察糖尿病性高血糖对母体胎盘功能以及子代生长发育的影响［8］。该类模型受孕率低、模型死亡率和流产率较高，其成功孕产子代数量极少，不利于研究母体孕期高血糖对子代的长远影响。另有研究者在大鼠妊娠0天时给予35mg/kgSTZ尾静脉注射，至妊娠第20天时，其孕鼠和胎鼠体重均显著低于空白对照组［9］。然而在人类临床诊疗中，过高的血糖往往能够得到控制，此类子代宫内生长受限的情况大大减少，因此一些研究者对如何应用STZ诱导宫内高血糖环境下的高出生体重子代进行了探索。Segar等［10］的研究中使用50mg/kgSTZ在妊娠第13天一次性腹腔注射，用以复制妊娠中晚期GDM大鼠模型，其空腹血糖在STZ注射后第3、4天达到最高值(约25～30mmol/L)，至分娩呈逐渐下降趋势，所孕产子代出生体重根据血糖升高的轻、重程度呈现相应巨大儿及宫内生长受限的表现。毕晶珠等［11］则采用孕前给予大鼠25mg/kgSTZ一次性腹腔注射，由于胰岛细胞受到部分破坏，大鼠妊娠后血糖应激性升高，部分大鼠血糖水平较孕前升高20%以上，可孕产一定数量的高出生体重子代。综上所述，应用STZ复制GDM大鼠模型常用剂量为25～65mmol/L，根据不同的研究目的，可根据STZ用药后母鼠死亡率、血糖水平及子鼠出生体重、发育成形情况，以及有一定的发育畸形率等情况，来判断GDM模型的成功与否。

1．2四氧嘧啶(alloxan，ALX)四氧嘧啶是一种β细胞毒剂，化学性质不稳定，产生氧自由基，易与SH基(主要是半胱氨酸)发生反应，影响细胞代谢。动物的胰岛β细胞中SH基含量高，故选择性地损伤多种动物的胰岛β细胞，使β细胞制造胰岛素的功能发生障碍而导致血糖过高和糖尿病。胰岛外分泌功能不受损伤，胰岛β细胞不是功能消失，而是功能不同程度的降低，有利于研究胰岛组织的再生和功能的恢复。ALX的用量差异较大，多在40～200mg/kg之间。研究表明，剂量过小不能达到破坏胰腺β细胞的有效浓度，使其在短时间内修复至正常，从而导致模型失败。通过对应用不同剂量ALX和不同给药途径制作糖尿病妊娠大鼠动物模型进行探讨，综合成模率、死亡率、转阴率考虑，认为静脉注射给药40mg/kgALX是复制糖尿病妊娠大鼠动物模型的较好途径。应用此方法复制GDM大鼠模型后，发现孕鼠孕期体重增长幅度及子代出生率、出生体重均显著低于空白对照组［12］。将ALX应用于复制GDM大鼠高出生体重子代方面的研究资料较匮乏。综合以上两种应用化学方法破坏大鼠胰腺，从而导致大鼠孕期血糖升高的造模实践，大多数研究者均采用了给药前禁食的方法，其依据是:STZ和ALX均可对胰岛β细胞产生毒性作用，破坏β细胞，然而这种毒性可通过给予葡萄糖或其类似物使之减弱或消失。另外禁食可以满足用适合的给药量达到最大的胰腺破坏程度，同时使ALX对肝、肾等脏器的损伤减轻。两种药物比较，STZ优于四氧嘧啶，具有造模稳定、快速、种属选择性不强、组织毒性相对较小等优点，故在GDM实验性大鼠模型中STZ较为常用。

1．3激素性DM在DM动物模型中，有文献报道，通过注射肾上腺皮质激素(AD)、生长激素、甲状腺素、胰高血糖素及儿茶酚胺类激素等，均可直接或间接制备内分泌性DM。糖皮质激素和胰高血糖素均可促进糖原异生，抑制外周组织对葡萄糖的利用，即降低胰岛素的效能;生长激素使外周组织利用葡萄糖发生障碍，对胰岛素敏感性降低，刺激β细胞过度分泌，终致衰竭产生DM。甲状腺素除可以提高糖尿病动物的基础代谢外，小剂量外源性甲状腺素还能促使大鼠胰腺β细胞凋亡。Jorns等［13］在实验中发现，甲状腺素能使动物和人的糖耐量下降，这种结果伴随着胰岛β细胞数量的减少。激素性DM模型较方便，所需仪器设备简单、易行，一般实验室都可进行，但应用激素类药物制造动物糖尿病模型有几个共同的缺点，如:给药需时长，停药后缓慢恢复至正常;测定的血糖不完全是葡萄糖，专一性不强。

1．4高渗葡萄糖注射在宫内高血糖环境对子代出生体重的影响方面，人类临床流行病学研究中发现，糖尿病性巨大儿的发生主要受早孕期血糖水平的调控［14］。曾有学者采用皮下注射高渗葡萄糖的方式人为建立单纯性高血糖小鼠模型。后来有学者通过给予怀孕不同阶段的大鼠2g/kg葡萄糖腹腔注射后，分别观察其胎盘重量及子代出生体重，结果发现，虽然孕晚期的短暂(4h)高渗葡萄糖注射对子鼠出生体重没有明显影响，但在怀孕初期高渗葡萄糖注射组胎盘重量显著增加，认为宫内高血糖环境对子鼠生长发育的影响和调节与妊娠初期胎盘作用有关［15］。上述应用高渗葡萄糖注射来复制高血糖大鼠模型的方法由于其操作不便，且与GDM发病机理不符，故在动物研究中应用受限。

2饮食诱导

有学者认为，脂肪毒性(lipotoxicity)和葡萄糖毒性(glu-cotoxicity)在2型糖尿病发病机理中有重要意义。循环血液中脂肪酸和葡萄糖含量的增加，可引起外周组织的胰岛素抵抗和胰腺β细胞合成分泌胰岛素功能减退甚至衰竭致失代偿，引起血糖升高［16］。DM动物模型研究中，许多学者在造模方法中引入了高脂、高糖饮食诱导因素以更好地模拟人类临床糖尿病的病因及发病特点［17］。因此，在GDM大鼠模型的复制过程中，亦有许多学者对上述饮食诱导造模方法进行了尝试和改良。

2．1单纯高脂饮食诱导肥胖，尤其是腹型肥胖可通过参与胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能障碍的病理机制引起胰岛素抵抗。研究表明［18］，成年雌性Wistar大鼠在接受4周自助式高脂饮食(cafeteria-stylehighfatdiet，CAF)后，体重显著增加，且在孕期应激因素刺激下出现胰岛素抵抗，该模型虽然未观察到人类临床GDM多发的巨大儿，也未对子代远期影响进行观察研究，但其发病机理与人类临床GDM相近，同时也避免了应用STZ等药物直接损伤胰腺功能所导致的血糖极度升高或不稳定，排除了药物可能直接引起的宫内子代胰腺发育，具有一定的合理性。另有研究表明，单纯孕期的高脂饮食喂养可直接导致胎鼠出现血糖升高和胰岛素分泌功能障碍。Cerf等［19］的研究认为，其可能机理为孕期高脂饮食降低胰腺-十二指肠同源盒基因-1(PDX-1)和葡萄糖激酶(GK)，从而干预子鼠胰腺发育的程序化。其中，前者在胚胎胰腺发育、分化中起重要作用，而GK则是胰岛素分泌的葡萄糖感受器，其活性下降可导致糖代谢紊乱的发生。

2．2高脂饮食结合STZ注射DM的相关动物研究认为，高脂喂养大鼠的胰岛β细胞对STZ的敏感性增加，从而可降低STZ用量，以减轻药物本身对孕鼠肝、肾功能的损害和直接损害胎鼠的胰腺发育。根据实验目的不同，各研究高脂饲料配方和STZ浓度均有差别。高脂饲料中脂肪所提供热量占总热量的百分比从30%～45%不等，而STZ使用的药量也根据给药方法的不同用量不等，一般为25～65mmol/L［20］。然而，以上单纯高脂饮食喂养和高脂饮食结合STZ注射的方法所诱导的实验性GDM大鼠模型均未见其子代出生体重的显著增加。针对临床上GDM孕妇多见孕产巨大儿的情况，有研究者在采用高脂饮食结合STZ注射方法基础上，摸索STZ注射的剂量与给药时间，以期更好地模拟GDM的发病和临床特点，增加实验性GDM大鼠模型的实用价值。Soulimane-Mokhtari等［21］采用整个孕期和哺乳期给予Wistar大鼠高脂饮食基础上，在妊娠第15天再给予40mg/kg一次性腹腔注射，其血糖呈轻度升高，且子代出生体重显著高于空白对照组。

3手术诱导

100多年前，Minkowski和VonMehring首创全胰切除术制造的DM模型，比较稳定，胰岛素绝对缺乏，伴高血糖、糖尿和酮症酸中毒，如不经治疗可导致死亡。国内外学者对此法作了改良并取得了成功。将实验动物全胰或部分切除，保存胰十二指肠动脉吻合弓，连续2天血糖值超过11．1mmol/L或行口服葡萄糖耐量实验(oralglucosetolerancetest，OGTT)时，2h血糖值仍未恢复到注射前水平，即基本形成DM。早在1911年，Carlson和Drennan首次通过切除胰腺研究了糖尿病对妊娠犬的影响。但上述实验操作不易，因妊娠动物对切除胰腺非常敏感，过高的血糖通常导致其不易受孕、流产或死产;而最严重的问题在于胰腺切除所致糖尿病是将胰腺α细胞和β细胞同时切除，而人类临床GDM的发生以β细胞功能下降为主。基于上述原因，手术诱导GDM的方法难以推行。综上，虽然也有研究采用自发性动物模型研究GDM，但大部分自发性动物模型是通过人为定向培育而成的，毕竟不同于人类自然发病情况。因此，自发和诱发模型所具有的优缺点只是相对的。对使用者来说，最重要的是所选择的模型究竟能否达到研究目的。