来曲唑治疗大鼠子宫内膜异位症模型异位病灶的作用机制

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[摘要] 目的 研究来曲唑治疗大鼠子宫内膜异位症的作用机制。方法 采用子宫内膜自体移植法进行子宫内膜异位症建模，2015年3月，选择30只建模成功的大鼠，根据随机数字表法分为来曲唑组和对照组，各15只。曲唑组大鼠每日给药来曲唑灌胃，给药剂量为0.26 mg/kg，1次/d；对照组灌胃等体积的0.9%NaCl注射液。采用免疫组织化学法对异位病灶组织中细胞间黏附因子（ICAM-1）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）、血管内皮生长因子（VEGF）的表达情况。逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测病灶中白细胞介素6（IL-6）mRNA、肿瘤因子（TNF）αmRNA，NF-κB mRNA，细胞色素芳香化酶（P450 arom）mRNA，环加氧酶2（COX-2）mRNA的表达。 结果 治疗后来曲唑组子宫异位内膜体积较对照组显著降低[（158±23）mm3 vs （28±3）mm3]，差异有统计学意义（P

[关键词] 子宫内膜异位症；来曲唑；大鼠；作用机制

[中图分类号] R711 [文献标识码] A [文章号] 1674-0742（2017）01（b）-0005-05

[Abstract] Objective To research the function mechanism of letrozole in treatment of rat endometriosis model ectopic lesions. Methods The model of endometriosis was established by the endometrial auto-transplantation， 30 rats with successful model were selected and randomly divided into two groups with 15 cases in each， the letrozole group adopted letrozole with 0.26 mg/kg once a day for gavage， the control group adopted the 0.9%NaCl injection for gavage， and the expression of ICAM-1， MMP-9 and VEGF in the ectopic lesion tissues was tested by the immunohistochemical method， and the expression of 6（IL-6）mRNA， （TNF）αmRNA， NF-κB mRNA， （P450arom）mRNA and 2（COX-2）mRNA were tested by the RT-PCR. Results After treatment， ectopic endometrial volume in the letrozole group obviously decreased compared with that in the control group[（158±23）mm3 vs （28±3）mm3]， and the difference had statistical significance（P

[Key words] Endometriosis uterine； Letrozole； Rat； Function mechanism

子宫内膜异位症是妇科常见的一种疾病，该病在育龄妇女人群中的发病率可高达10%，而在不育妇女当中的发病率为30%～60%，这说明子宫内膜异位症与妇女不育有着密切关系[1]。近年来关于该病的研究逐渐增多，但其发病机制仍未能得到合理解释，Chen等[2]发现子宫内膜异位症患者异位病灶局部存在高浓度雌激素，从而认为雌激素合成重要限速酶芳香化酶P450与子宫内膜异位症的发生存在密切关系。临床对该病的治疗方式主要有手术和药物治疗，促性腺激素释放激素激动剂类药物是目前公认的能够有效治疗子宫内膜异位症的药物，临床应用较多，此外，诸如达那唑、孕激素以及短效口服避孕药等药物也可有效缓解患者临床症状[3]。但激素类药物的使用往往会引起多种并发症，近年来关于芳香化酶抑制剂类药物在子宫内膜异位症治疗中的研究逐渐增多，初步认为其具有较好的临床疗效，但关于其作用机制尚不明确[4]。为此，该研究拟以大鼠为实验动物，2015年3月，选择30只大鼠，构建大鼠子宫内膜异位症模型，旨在探讨第三代芳香化酶抑制剂来曲唑对子宫内膜异位症的作用及其机制，为其临床推广提供依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择无特定病原体雌性，性成熟未孕大鼠30只（山东鲁抗医药公司实验动物室，许可证号：SCXK鲁20050017），体质量（228.4±10.6）g；来曲唑（生产批号：201411253），0.9%NaCl注射液（生产批号：201410242）。雌二醇放射免疫分析试剂盒，孕酮放射免疫试剂盒，睾酮放射免疫分析试剂盒，人促卵泡生成激素放射免疫试剂盒，人促黄体生成素放射免疫分析试剂盒；基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）、血管绕ど长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α），人核转录因子κBp65（Human Nuclear transcription factor-κBp65， NFκBp65），检测试剂盒购；BCA蛋白定量试剂盒，SP免疫组织化学染色试剂盒，3，3-二氨基联苯胺显色试剂盒。

1.2 大鼠子宫内膜异位症模型构建

大鼠购进后适应性饲养1周后开始实验，每日对大鼠进行阴道图片检查，选择具有连续2个规律性较强的动情周期的大鼠，在第3个动情周期时采用子宫内膜自提移植法[5]进行建模，为避免伤口感染，所有操作应在无菌环境下进行。建模操作完成后第4周在动情期进行开腹检查，评估模型构建情况，建模成功标准为移植物囊性增大，内包含清亮的囊液，囊壁表面形成血管和少量的结缔组织，测量囊肿体积。病理学组织检查可见间质细胞、腺上皮细胞和腺体。

1.3 动物分组及处理

选择30只建模成功的雌性大鼠，按随机数表法随机分为来曲唑组和对照组，各15只，体重218～244 g，平均（231±3）g，曲唑组大鼠每日给药来曲唑灌胃，给药剂量为0.26 mg/kg，1次/d；对照组灌胃等体积的0.9%NaCl注射液。两组大鼠均灌胃给药3周，停药后进行开腹。

1.4 样品采集

以水合氯醛腹腔注射进行麻醉，通过左侧股动脉切断放血法处死试验动物，在其死亡前采集所需标本。①非抗凝管采集大鼠股动脉血4 mL，凝固后以3 000 r/min离心15 min，离心半径13.5 cm，分离血清，在4℃冰箱中保存备用（24 h以内）。②采用两脚规测定异位子宫内膜生长情况 。③完全摘取异位子宫内膜，置于离心管中，放在液氮中保存备用。④异位病灶组织以甲醛固定，石蜡包埋，用于免疫组织化学检测各项指标。

1.5 观察指标及检测方法

①采用放射免疫法检测各组大鼠血清中雌二醇，睾酮，促黄体生成素，孕酮，促卵泡生成素水平。②采用免疫组织化学法对异位病灶组织中细胞间黏附因子1（intercellular adhesion factor-1，ICAM-1）、MMP-9、VEGF的表达情况。在光学显微镜下分析结果，切片组织或细胞中发现黄褐色颗粒者为阳性，每张切片选取5个视野，在AHB-2-HL摄像系统提取数据，按平均光密度值定量。③逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）检测病灶IL-6mRNA、TNF-αmRNA，NF-ΚB mRNA，细胞色素芳香化酶（P450arom）mRNA，环加氧酶2（cyclo-oxygen-ase-2，COX-2）mRNA的表达。用Trizol 一步抽提法抽提组织mRNA；逆转录反应参照逆转录试剂盒说明书进行；标准PCR反应体系扩增基因；半定量分析法分析目的基因。④分别在造模后第1次开腹及停药后第2次开腹时测量异位子宫内膜的体积。

1.6 统计方法

应用SPSS 20.0统计学软件对数据进行分析，计量资料用均值±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，P

2 结果

2.1 两组大鼠异位子宫内膜生长情况

治疗前两组大鼠子宫异位内膜体积差异无统计学意义（P>0.05）。对照组治疗前后子宫异位内膜体积差异无统计学意义（P>0.05）；来曲唑组治疗后子宫异位内膜体积较治疗前显著降低，差异有统计学意义（P

2.2 两组大鼠血清激素水平比较

砬唑组大鼠雌二醇，孕酮水平均显著低于对照组，睾酮，促卵泡生成素和促黄体生成素水平均显著高于对照组，差异有统计学意义（P

2.3 两组大鼠异位子宫内膜组织中的ICAM-1，MMP-9和VEGF的表达情况

来曲唑组大鼠异位子宫内膜组织中的ICAM-1，MMP-9和VEGF的表达水平均显著低于对照组，差异有统计学意义（P

2.4 两组大鼠异位内膜组织中IL-6mRNA，TNF-αmRNA和NF-κBmRNA

来曲唑组IL-6mRNA，TNF-αmRNA和NF-κBmRNA表达水平均显著低于对照组，差异有统计学意义（P

3 讨论

子宫内膜异位症是一种雌激素依赖性疾病，机体除卵巢外，脂肪、皮肤以及异位内膜均可分泌雌激素[6]。目前国际认可的治疗子宫内膜异位症的药物促性腺激素释放激素虽能取得一定的临床疗效，但其仅能抑制卵巢合成雌激素，而对其他组织分泌雌激素无作用，因此该类药物临床疗效并不理想，且治疗后容易复发。该研究主要研究药物来曲唑是第三代芳香化酶抑制剂，研究表明其能有效阻断卵巢或其他组织中的雄激素转化为雌激素的途径，进而降低机体血清和异位病灶局部雌激素水平，从而发挥治疗作用[7-8]。该研究通过用来曲唑干预采用自体移植构建子宫内膜异位症模型的大鼠，分析其对异位病灶体积的影响评估其临床疗效，同时对多种血清激素水平及多种细胞因子和酶的表达情况进行测定，旨在探讨其作用机制，最终为其在临床推广应用奠定基础。

该研究结果表明治疗前两组大鼠异位病灶体积差异无统计学意义（P>0.05），进行3周干预后，来曲唑组大鼠异位病灶体积显著缩低于对照组（P

该研究对两组大鼠血清激素水平进行分析，结果表明来曲唑组雌二醇（E2），孕酮（P）水平均显著低于对照组，差异有统计学意义（P

此外，该研究还分析了干预后病灶组织中ICAM-1、MMP-9和VEGF的表达水平，这是因为子宫内膜异位症的形成需经过“黏附、侵袭和血管形成”3个阶段，而上述3种细胞因子经研究发现在子宫内膜异位症患者的病灶、血清及腹腔液中均有较高水平的存在，而治疗后均显著降低[10-12]。同时ICAM-1在异位病灶中的存在能够增强异位内膜的稳定性及黏附性，从而促使其在异位部位的生长；MMP-9能够促进血管内皮细胞出芽形成新血管，增强细胞间黏附，从而促进子宫异位内膜的侵袭和生长；VEGF则能够增强机体微静脉、小静脉的通透性，诱导新血管的形成[13]。该研究结果表明，来曲唑组大鼠异位子宫内膜组织中的ICAM-1、MMP-9和VEGF的表达水平均显著低于对照组，差异有统计学意义（P

IL-6是一种重要的多功能细胞因子，其能够增强腹腔炎症反应，加快异位灶细胞的增殖、黏附和血管形成；TNF-α则能够增强子宫内膜基质细胞与细胞外基质之间的黏附力，与子宫内膜异位症的严重程度密切相关[14]；NF-κB则被认为是子宫内膜发病机制中的枢纽，其能诱导多种致炎因子、趋化因子和黏附因子的表达。该研究结果表明，来曲唑组IL-6mRNA、TNF-αmRNA和NF-κB mRNA表达水平均显著低于对照组，差异有统计学意义（P

P450arom是雌激素合成的限速酶，而前列腺素E则是 P450arom 生成的强诱导剂，同时前列腺素E的合成受COX-2限制。该研究结果表明来曲唑组大鼠异位病灶中P450arom mRNA和COX-2 mRNA表达量显著低于对照组，差异有统计学意义（P

综上所述，来曲唑对子宫内膜异位症模型大鼠异位病灶具有明显的抑制作用，其作用机制可能是来曲唑能够降低ICAM-1、MMP-9、VEGF、IL-6、TNF-α和NF-κB 等细胞因子水平以及降低P450arom和COX-2等催化酶水平抑制雌激素合成有关。

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