UPLC―ESI―Q―TOF―MS/MS分析槲皮苷在大鼠
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[摘要]该试验主要研究槲皮苷在大鼠肠道菌群中的代谢情况及其可能的生物转化途径，为中药糖苷类成分的代谢机制奠定基础。建立超高效液相色谱串联电喷雾飞行时间质谱测定槲皮苷及其代谢产物的分析方法，流动相为01%甲酸水01%甲酸乙腈，梯度洗脱，流速为03 mL・min-1，扫描方式为电喷雾负离子模式，将大鼠肠道菌群在体外与槲皮苷共同孵育使其发生代谢，采用此方法对其代谢产物进行检测分析，结合Metabolite ToolsTM，质量亏损过滤（MDF）等技术，对代谢产物进行筛查分析以及推测代谢产物化学式。结果显示，槲皮苷发生脱糖、脱氧、乙酰化等反应，脱糖生成的苷元槲皮素进一步发生羟基化、脱氧、还原、开环等反应，得到槲皮素脱氧代谢产物山柰酚、槲皮素C2C3双键加氢还原产物花旗松素、槲皮苷脱糖基产物槲皮素等。研究结果表明槲皮苷能够在大鼠肠道菌群中发生代谢，增加了化合物的疏水性和化学多样性。
[关键词]槲皮苷； 肠道菌群； uplcQTOFMS/MS； 代谢
Analysis of metabolites of quercitrin in rat intestinal flora by using
QIN Xiaoli1，2，4， SUN Huiyuan1，2 ， YANG Wu1，2 ， LI Yongjun3， ZHENG Lin1 ， LIU Ting1， HUANG Yong1*
（1 Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics， Guiyang 550004， China；
2 School of Pharmacy， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China，
3 Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and Traditional Chinese Medicine，
Ministry of Education， Guiyang 550004， China，
4 National Engineering Research Center of Miao′s Medicines， Guiyang 550004， China）
[Abstract]To investigate the metabolism of quercitrin in rat intestinal flora and possible biological pathways， laying the foundation for the metabolic mechanism of traditional Chinese medicine glycosides ingredients UPLCQTOFMS/MS method was established to detect the quercitrin and its metabolites with 01% formic acid solution（A）01% formic acid acetonitrile（B） as the mobile phase for gradient elution at a flow rate of 03 mL・min-1 Electrospray negative ion mode was applied to analyze the metabolites of quercitrin in rat intestinal flora Metabolite ToolsTM， mass defect filter（MDF） and other technologies were used to screen， analyze the metabolites and infer the chemical formula of the metabolites The results showed that quercitrin would have degalactoside， deoxygenation and acetylation reactions， and the aglycone quercetin resulted from degalactoside would have further reactions such as hydroxylation， deoxygenation， reduction， and ring opening to achieve deoxygenation metabolite kaempferol， C2C3 double bonds hydrogenation and reduction product taxifolin， and degalactoside product quercetin The research results showed that quercitrin can be metabolized by rat intestinal flora， which could increase their hydrophobicity and chemical diversity
[Key words]quercitrin； intestinal flora； UPLCQTOFMS/MS； metabolism
中药糖苷类成分是中药中一类重要的活性成分，其突出的药效活性受到广泛关注，相关研究表明，糖苷类成分在肠道较难吸收，生物利用度低，在体内难直接发挥作用[1]，然而却能发挥药效，这可能是肠道中存在大量的细菌[2]，使糖苷代谢成各种代谢产物，其代谢产物可能才是真正起药理活性的成分，因此口服中药糖苷类成分的活性与肠道菌群密不可分。而槲皮苷是由槲皮素和鼠李糖基组成的糖苷，具有中枢抑制、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、抗炎镇痛等作用[3]，在三七、银杏叶、荭草花、头花蓼等药材中均含有此成分。目前国内研究槲皮苷的理药效[3]、吸收[46]等较多，但是关于槲皮苷在大鼠肠道菌群中的代谢情况尚不明确，因此本文采用UPLCQTOFMS/MS联用技术，并在厌氧环境下研究槲皮苷在大鼠肠道菌群中的代谢规律，对槲皮苷及其类型的糖苷代谢机制具有十分重要的意义。
1材料
CDH6000BⅡ电热恒温培养箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；SWCJ2FD超净工作台（苏州苏洁净化设备有限公司）；YXQLS18SI手提式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司）；厌氧产气袋（AnaeroPackAnaero，MGC，日本三菱瓦斯化学株式会社）；厌氧培养罐（PackRectangular Jars，日本三菱瓦斯化学株式会社）；Agilent Technologies 1290 Infinity液相色谱系统（包括1290 Infinity二元泵，高性能自动进样器，二级管阵列检测器，柱温箱）；ESIQTOFMS（布鲁克道尔顿电喷雾四极杆飞行时间质谱仪，包括Metabolite ToolsTM，MDF技术等）；Allegra 64R低温高速离心机（美国Beckman Coulter 公司）；MTN2800D氮吹浓缩装置（天津奥特塞恩斯仪器有限公司）；EL204电子天平（梅特勒托利多仪器有限公司）。
营养琼脂培养基（批号2014030401）和小牛浸膏（批号2014010800）购于杭州微生物试剂有限公司；硫酸铵（批号20120305）购于重庆川江化学试剂厂；磷酸氢二钾（批号20130722）和碳酸钠（批号20131206）购于上海化学试剂总厂；无水氯化钙（批号2013101801）和硫酸镁（批号20130522）购于成都市科龙化工试剂厂；磷酸二氢钾（批号120202）和氯化钠（批号130927）购于西陇化工股份有限公司；L半胱氨酸（批号100125）购于上海蓝季科技发展有限公司；L抗坏血酸（批号402C036）购于北京索莱宝科技有限公司；蛋白胨（批号130941）购于上海博微生物科技有限公司；槲皮素对照品（批号1166101216）购于中药固体制剂制造技术国家工程研究中心；槲皮苷（批号MB6680）和山柰酚（批号MB6888）对照品购于大连美仑生物科技有限公司；花旗松素对照品（批号 111816201102）购于中国食品药品检定研究院；乙腈、甲酸为色谱纯（德国Merck 公司）；水为屈臣氏超纯水；其他试剂均为分析纯。
健康SD大鼠，雌雄兼用，体重（200～240） g，由贵州医科大学动物中心提供，编号SCXK（黔）20020001。动物进入实验室后，雌雄分饲，由专人饲养管理，动物室按常规定期消毒。
2方法
21色谱条件
Agilent Eclipse Plus C18 RRHD色谱柱（21 mm×100 mm，18 μm）；流动相01%甲酸水（A）01%甲酸乙腈（B），梯度洗脱，0～10 min，95%～55%A，10～14 min，55%～5% A，14～15 min，5%～0%A，15～16 min，0%～95%A；柱温45 ℃；流速03 mL・min-1，进样量2 μL。
22质谱条件
电喷雾离子源（ESI），扫描方式为负离子模式（ESI-，m/z 50～1 000）；毛细管电压3 kV，锥孔电压80 V；离子源温度110 ℃，雾化气温度200 ℃，雾化气（N2）压力 12 bar，流速80 L・min-1；脱溶剂气温度300 ℃，雾化气（N2）体积流量50 L・h-1，脱溶剂气体积流量550 L・h-1。准确质量测定采用甲酸钠校正标准液，校正模式选用Enhanced Quadratic。数据分析：Data Analysis软件，Metabolite ToolsTM 软件（包括Metabolite Predict及Metabolite Detect），质量亏损过滤（MDF）。
23厌氧培养液的制备[7]
A液375 mL（078% K2HPO4），B液375 mL[047% KH2PO4，118% NaCl，12% （NH4）2SO4，012% CaCl2，025% MgSO4・H2O]，C液50 mL 8% Na2CO3。05 g L半胱氨酸，2 mL 25% L抗坏血酸，1 g牛肉膏，1 g蛋白胨，1 g营养琼脂，加蒸馏水至1 L，盐酸调pH 75～80。
24大鼠肠道菌液的制备[8]
将健康大鼠断颈处死后，迅速开腹取其大肠段粪便，将新鲜粪便与生理盐水按1∶4混合制成混悬液，5 000 r・min-1离心5 min，上清液即为大鼠肠道菌液。
25样品的制备
251肠菌培养液取新鲜配制的肠道菌液2 mL于培养皿中，加入厌氧培养液18 mL（已灭菌），混合均匀，即得20 mL肠菌培养液。将此肠菌培养液置于厌氧培养罐中，加入1个厌氧产气袋后，迅速盖上培B罐盖以保证培养环境厌氧[910]，置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，使肠菌培养液中的肠道菌充分成长。
252试验分组24 h后取出培养皿，将上述肠菌培养液平均分为2份，每份10 mL。实验分为3组，将槲皮苷加入10 mL肠菌培养液中得给药组，10 mL肠菌培养液（不含槲皮苷）为空白组，将槲皮苷加入10 mL厌氧培养液（不含肠菌）为对照组。每个样品平行操作3次。将上述培养皿迅速放入厌氧培养罐中，放入1个厌氧产气袋，以保证培养环境厌氧[910]，置于37 ℃恒温培养箱中培养12 h。所用器具均经高压蒸汽121 ℃灭菌20 min。
26样品处理方法
将25项下培养得到的样品分别转移至50 mL离心管中，每管中加入乙酸乙酯10 mL，涡混震摇3 min，提取3次，合并萃取液，5 000 r・min-1离心5 min，取上清液，在37 ℃下N2吹干，残渣加1 mL乙酸乙酯溶解后37 ℃下N2吹干，残渣加200 μL 50%甲醇溶解，15 000 r・min-1离心5 min，上清液UPLCQTOFMS/MS进样分析。
3结果
31代谢产物分析
在26项下，运用Metabolite Tools软件中的Metabolite Predict对槲皮苷进行代谢产物预测，将生成的代谢产物MassList导入Metabolite Detect中得到槲皮苷大鼠肠道菌孵育样品、大鼠空白肠道菌孵育样品、槲皮苷厌氧培养液孵育样品等的图谱及差异图谱，结果见图1。
覃小丽等：UPLCESIQTOFMS/MS分析槲皮苷在大鼠肠道菌群中的代谢
32化合物鉴定
由Metabolite Detect软件对样品及空白图谱处理后得到的差异图谱可知，在大鼠肠道菌孵育样品中找到9种化合物，即M0（m/z 447094 3），M1（m/z 317030 5），M2（m/z 303054 3），M3（m/z 305068 6），M4（m/z 431105 1），M5（m/z 489106 3），M6（m/z 489106 3），M7（m/z 301038 1），M8（m/z 301038 1），见表1。
321M0tR 61 min色谱峰的准分子离子为m/z 447094 3[M-H]-，主要碎片离子峰为m/z 301037 9 [M-H-C6H10O4]-，与槲皮苷对照品相同，由此确定化合物M0为原型成分槲皮苷。
322M1tR 45 min色谱峰的准分子离子为m/z 317030 5[M-H]-，由Smart Formula预测其化学式为C15H9O8，与原型化合物m/z 447094 3[M-H]-相比减少了130，为失去1个鼠李糖基生成槲皮素的衍生物，且其保留时间较槲皮素缩短，亲水性增加，可能是槲皮素再羟化的结果，故推测M1为槲皮素的羟基化代谢产物，但本实验的数据并不能说明具体羟化位置，有待进一步研究。
323M2tR 56 min色谱峰的准分子离子为m/z 303054 3[M-H]-，主要碎片离子峰为m/z 285[M-H-H2O]-，与花旗松素对照品相同，确定tR 56 min的M2为槲皮素C2C3双键加氢还原产物，即花旗松素。
324M3由Metabolite Detect软件对样品及空白图谱处理后得到的差异图谱中可知，tR 58 min色谱峰的准分子离子为m/z 305068 6[M-H]-，m/z 183031 0 [M-H-C7H6O2]-，125024 9[M-H-C7H6O2-COO-CH2]-为主要碎片离子峰，由此推测tR 58 min的M3为苷元C2C3双键加氢还原后OC2键开环产物。
325M4由Metabolite Detect软件对样品及空白图谱处理后得到的差异图谱可知，tR 68 min色谱峰的准分子离子为m/z 431101 5[M-H]-，由Smart Formula预测其化学式为C21H19O10，且其保留时间较槲皮苷延长，疏水性增加，由此推测tR 68 min的M4为槲皮苷脱羟基产物。
326M5和M6由Metabolite Detect软件对样品及空白图谱处理后得到的差异图谱可知，tR 72，76 min色谱峰的准分子离子皆为m/z 489106 3[M-H]-，主要碎片离子峰为m/z 447094 7[M-H-C2H2O]-，301145 1[M-H-C2H2O-C6H10O4]-，由此推测tR 72，76 min的M5，M6为槲皮苷乙酰化代谢产物，具体的乙酰化位置有待进一步研究。
327M7tR 80 min色谱峰的准分子离子为m/z 301038 1[M-H]-，与M0相比减少了146，与槲皮素对照品相同，由此确定tR 80 min的M7为槲皮苷脱糖基后的苷元，即槲皮素。
328M8tR 92 min色谱峰的准分子离子为m/z 285043 1[M-H]-，与M7相比减少了16，与山柰酚对照品相同，确定tR 92 min的M8为槲皮素3′脱氧代谢产物，即山柰酚。
33槲皮苷代谢产物及其可能的代谢途径
根据上述分析，推测槲皮苷代谢产物及其可能的代谢途径见图2。
4讨论
槲皮苷属于中药黄酮糖苷类。过去一直认为黄酮类物质槲皮苷及其衍生物很少被吸收，但近几年有关研究显示，槲皮苷及其衍生物进入机体后，有一部分通过被动吸收和主动转运而被机体吸收利用[11]，但是槲皮苷在体内并不是完全以原型成分吸
收入血，而是在体内代谢转化器和酶系的多样性作用下，受到大量的肠道菌群作用，影响其代谢转化和机体的吸收利用[1213]。
传统中药的使用大多数是通过口服吸收而发挥作用，药物在生物体内作用不可避免与肠道菌群接触。肠道是一个庞大而富有活力的细菌菌群栖息地，人和动物肠内菌丛数量和种类繁多，且99%是厌氧性细菌，其中以拟杆菌族、链状细菌、消化链球菌、螺菌属等专性厌氧菌和乳酸菌及双歧杆菌占优势。研究发现在人肠内细菌中的梭杆菌K60能够使槲皮苷的糖苷键嗔焉成槲皮素，拟杆菌JY6和双歧杆菌B9能够使槲皮苷的B环开裂[14]。人体的肠道菌群分布特征与大鼠比较相似，并且本课题前期研究槲皮苷在人肠道菌群中的代谢情况也是主要以脱糖基反应为主。因此，槲皮苷的糖苷键断裂生成槲皮素可能与大鼠肠内细菌中的梭杆菌K60有关，确认有待进一步研究。
本实验采用体外大鼠肠道菌群孵育法，能在较短时间内得到大量的代谢产物，比较方便解决一些复杂药物代谢研究的问题，代谢环境易于控制，代谢体系比较纯净，在代谢物结构鉴定方面具有较大的优势[15]。通过UPLCQTOFMS/MS联用技术，运用Metabolite Predict，Metabolite Detect对样品中的代谢产物进行预测并检测分析，结合Mass Defect Filter技术进一步有效提取代谢产物信息，排除基质背景干扰，并应用Data Analysis中Smart Formula功能推测代谢产物化学式。结果表明槲皮苷在大鼠肠道菌群中主要以脱糖基反应为主，苷元槲皮素进一步发生羟基化、脱氧、还原、开环一系列反应，更容易吸收入血，提高药效。研究中药肠道代谢可以增加人们对中药复杂成分在体内生物转化途径的理解，为阐明中药复方相互作用规律、中药现代制剂的开发以及为中药及其复方制剂药效物质阐明奠定基础。
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[收稿日期]20160830
[基金项目]国家自然科学基金项目（81260688）；贵州省研究生卓越人才计划项目（黔教研合ZYRC字[2014]012）；现代药物研究开发协同创新中心项目（黔教合协同创新字[2013]04）；民族药与中药开发应用产学研基地建设项目（黔科合KY字[2013]122）；贵州省优秀青年科技人才培养对象专项（黔科合人字（2015）11号）
[通信作者]*黄勇，博士，教授，主要从事中药活性物质基础及药动学研究与药物新剂型、新技术研究，Tel：（0851）86908468，Email：mailofhy@126com
[作者简介]覃小丽，硕士研究生，主要从事活性物质基础与药物新剂型研究， Email：2806247283@qqcom