不同剂型夏桑菊颗粒HPLC指纹图谱及其模式识别分析

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[摘要]建立夏桑菊有糖和无糖颗粒的HPLC指纹图谱，为其鉴别与有效控制质量提供参考。采用高效液相法采集20批无糖型和34批有糖型夏桑菊颗粒指纹图谱，通过模式识别方法（主成分分析，正交最小二乘法判别分析）分类并筛选其主要差异组分；通过对照品对照的方法鉴定其主要的组分。成功建立夏桑菊有糖和无糖颗粒指纹图谱；主成分分析不能完全分类2种颗粒，而正交最小二乘法判别分析可明显的分为2类；2种颗粒之间差异最大的组分主要有6个，其中3个分别为异迷迭香酸苷、木犀草苷和蒙花苷。该研究建立的模式识别方法有助于夏桑菊颗粒整体质量控制，同时为其质量评价提供一种有效手段。

[关键词]HPLC 指纹图谱；模式识别；夏桑菊颗粒；主成分分析；正交最小二乘法判别分析

[Abstract]To establish the fingerprints of Xiasangju granules （with sugar and non-sugar forms） by HPLC， and provide reference for their identification and effective quality control. High performance liquid chromatography （HPLC） method was used to collect the fingerprints of 20 batches of non-sugar Xiasangju granules and 34 batches of sugar type Xiasangju granules. Their main different components were classified and screened by mode identification methods （principal component analysis， PCA， and orthogonal partial least squares discriminate analysis， OPLS-DA）. The principal components were identified by comparing with reference standards. The fingerprints of Xiasangju granules （sugar type and non-sugar type） were established. PCA could not fully classify the two types of granules， while OPLS-DA could obviously classify these two different types of Xiasangju granules. Six components showed greatest difference between two types of granules， including salviaflaside， luteoloside and linarin. The developed mode identification method is helpful to control the overall quality of Xiasangju granules， and it provides an effective approach to quality evaluation.

[Key words]HPLC fingerprint； mode identification； Xiasangju granules； principal component analysis； orthogonal partial least squares discriminate analysis

夏桑菊颗粒为纯中药制剂，主要由夏枯草、桑叶和野等3味中药组成，具有清肝明目，疏风散热，除湿痹，解疮毒之功效[1]。用于风热感冒，目赤头痛，高血压，头晕耳鸣，咽喉肿痛，疔疮肿毒等症，并可作清凉饮料。目前，国内外生产夏桑菊颗粒的企业105家，质量标准研究方面主要以蒙花苷、绿原酸、迷迭香酸、异迷迭香酸为指标的含量测定[2-5]。就类型而言，夏桑菊颗粒主要包括有糖型与无糖型等2种类型。同时，两者在工艺上也存在较大的差别，如无糖型以处方组分直接水煮提取进行制备；而有糖型，先乙醇浸渍提取部分野，然后再水提取剩余部分处方进行制备，最后加入野浸渍液体与适量蔗糖制得。因此，2种颗粒在工艺上有较大的差异，再加上中药复方本身成分的复杂性以及靶点的多样性，需要整体考虑其质量控制模式。

模式识别方法已被应用于多个学科的分析工作，包括药物的质量控制、差异标记物的筛选、植物分类等研究[6-8]。尤其在指纹图谱等多维的数据分析中显示出优势，也是其重要的分析手段，已经得到广泛的应用[9-10]。目前常用的方法主要分为2类，一类是无监督的分析方法主要有PCA，ICA，cluster等；另一类被称为有监督的分析方法，主要有PLS-DA，OPLS，DA，KNN，神经网络等[11]。随着数据的不断复杂，一些更先进的机器学习方法被应用，如支持向量机（SVM），随机森林（RF）等[12]。其中PCA，OPLS在多个学科取得了广泛的应用。并体现了其在复杂数据分析中的诸多优势，如较高的预测精度、广泛的适用性、线性数据的分析能力等。因而本文采用PCA，PLS-DA等手段分析有糖型与无糖型夏桑菊颗粒指纹图谱，寻到其主要的差异成分，为夏桑菊颗粒的质量标准和选择夏桑菊颗粒的含量测定指标提供很好的借鉴和参考。

1材料

KQ-100B型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；BPZ11D型电子分析天平（Sartorius公司）；Waters2695-2996高效液相色谱系统，Empower工作站，含四元梯度泵、自动进样器（Waters 公司）。

醋酸（分析纯，北京化工厂）；甲醇（色谱纯，TEDIA公司）；乙腈（色谱纯，Fisher公司）；水为娃哈哈纯净水。

夏桑菊颗粒由广州星群（药业）股份有限公司化验室提供。绿原酸、异迷迭香酸苷、木犀草苷、迷迭香酸以及蒙花苷均有本课题组自行分离得到，纯度经HPLC归一化法得大于98%。

2方法

2.1色谱条件

色谱柱Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速1.0 mL・min-1；检测波长290 nm；柱温30 ℃；进样体积10 μL；流动相乙腈（A）-水（B，含1.0 % 醋酸），梯度洗脱（0～10 min，5%A；10～20 min，5%～8.6%A；20～45 min，8.6%～17.6%A；45～70 min，17.6%～25.1%A；70～80 min，25.1%～32.1%A；80～90 min， 32.1%～37.1%A）。色谱图见图1。

2.2供试品制备

取夏桑菊颗粒约5 g，精密称定，加甲醇10 mL，称重，超声30 min（功率250 W，频率40 kHz），取出，静置，放凉，补足失重，0.22 μm微孔滤膜滤过，HPLC分析。

2.3精密度

按照2.2项下方法制备供试品1份，按照已经建立的HPLC分析条件，连续进样6次，计算保留时间及峰面积的精密度，结果表明该方法的精密度符合要求，其RSD小于5%。

2.4重复性

按照2.2项下方法所示，平行制备6份药材供试品溶液，然后进行HPLC分析，以主要成分峰面积为标准，考察方法重复性，结果表明方法的重复性在误差范围内。

2.5稳定性

按照2.2项下方法制备成药材供试品溶液后，在室温下放置不同时间，进行HPLC分析，以主要成分的峰面积计算，考察样品的稳定性，结果表明样品至少在48 h内是稳定的。

2.6数据处理与多变量统计分析

2.6.1原始数据的筛选与处理标准样品的确立包括样品的生产厂家、批号。参照峰的选择必须符合下列条件：①和相邻色谱峰分离良好，峰位居中；②是中药标准指纹图谱和各待检样品中所共有的色谱峰。基于以上原则，选择58.45 min的峰作为内参峰，已知为迷迭香酸，是目前夏桑菊颗粒的主要质量控制成分。所有的数据在进行统计分析之前，均做单位方差换算的处理。

2.6.2主成分分析（PCA）实际中，所获得的数据大多数为高通量多变量的数据，变量的个数越多，对整个数据的分析难度也就越大，因此在处理多变量数据时，往往需要对变量进行压缩分解，提取具有代表性的新变量。PCA基本思路即用一种方法将多指标或者多变量的信息综合成少数几个新的指标，这几个新指标既能够尽可能多地反映原来指标的信息，而且彼此间又差异显著，既不会过多地丢失有用信息，而且还能减少数据中的冗余信息[13]。

2.6.3正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）PLS（partial least squares）的基本运算是基于非线性迭代偏最小二乘算法（nonlinear iterative partial least squares，NIPALS），同时分解X矩阵和Y矩阵，并在分解X矩阵的时候利用Y矩阵的信息，在分解Y矩阵时利用X矩阵的信息，因此可以得到较好的回归结果[14]。偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）是基于偏最小二乘法上的一种监督模式识别方法。它的主要原理是先利用PLS提取样本的主成分，然后将主成分作为新变量建立训练样本自变量和分类变量之间的回归模型，进行判别分析[15]。而OPLS-DA是将正交信号校正方法（orthogonal signal correction， OSC）与偏最小二乘法相互结合同时对偏最小二乘法进行改进。OPLS是一种改进的PLS方法，它利用正交信号矫正（OSC）的思想，滤除了自变量矩阵（X）中与量矩阵（Y）无关的信息，即随机噪声。所以OPLS-DA可以更好地区分组间差异，提高模型的有效性和解析能力[16]。

3结果

3.1无监督模式识别-PCA 分析结果

采用PCA方法对2组样品建模，以共有峰的峰面积为自变量（X，以出峰时间标记峰的归属），以不同剂型夏桑菊颗粒为因变量（Y）。将Y设定设定为1/2的矩阵（无糖型设为1，有糖型设为2）。所有的数据导入到Simca-p软件进行聚类分析，利用其前3个主成分（PC1，PC2和PC3）进行画图区分，这3个主成分对于方差的总贡献度仅为65.43%，见图2。同时，从主成分分析的得分图可见，有糖型夏桑菊颗粒与无糖型夏桑菊颗粒分别位于左下角和右上角，有一定分开的趋势，但是中间部分有一定的重叠，表明PCA没法将这2类夏桑菊颗粒进行区分，见图3。因而，本文采取更加先进的模式识别算法对这2类夏桑菊颗粒进行区分。

3.2有监督模式识别-OPLS-DA分析结果

尽管无监督模式识别对不同剂型的夏桑菊颗粒显示出一定的分类效果，但达不到充分的验证目的。因此，本研究采用有监督的模式识别OPLS-DA建立分类模型。

OPLS-DA是一类适合具有共线性和噪音变量资料的分类的模式识别方法。已经广泛应用于不同类型的化学资料的分析，如色谱数据的分析。本研究通过OPLS-DA建模可得其聚类的结果，见图4。从结果可得夏桑菊颗粒以中线为中心明显的分为2类。同时对模型进行交叉验证，结果见图5。从模型验证的参数图可知，模型的主成分回归系数Q2Y=0.806 1>0.5，说明模型的预测能力较强；R2Y=0.874 1，说明模型对因变量变异贡献的百分比为87.41%，即这些自变量（共有峰）的变化能够解释导致不同分类（因变量）发生的87.41%。同时R2Y与Q2Y比较接近且均接近0.9，说明本研究建立的OPLS-DA模型能够很好的预测分类资料。

3.3差异标记物的筛选以及鉴定

提取OPLS-DA模型中个变量的VIP图，见图6，选择VIP>1的意义变量，可得在所有的变量中，17.48，50.46，51.81，54.55，61.19，71.91 min的峰对分类具有显著的影响。同时在OPLC-DA的载荷图中也清晰看出这6个物质的变量离远点的距离较远，说明这些物质是引起夏桑菊不同剂型成分差异的主要标志性成分，见图7。

将文献[2-5]中报道的关于夏桑菊颗粒质量控制的指标性成分按照同样的色谱条件进行对照分析，见图8，发现该模型中发现的6个标志物中有3个是已知的。经过对照得，50.46，51.81，71.91 min的峰分别为异迷迭香酸苷、木犀草苷和蒙花苷。

4讨论

与西药及中成药的其他剂型如胶囊、片剂等剂型不同，颗粒剂存在有糖型、无糖型等剂型。中成药颗粒剂存在此划分，主要是从口感出发，无糖、无蔗糖、乳糖型都是为特定人群设计的。目前，较少的研究关注其不同划分是否存在药物质量的差异或者其成分的影响。本研究以指纹图谱为手段，通过模式识别等化学计量学方法，建立了夏桑菊有糖与无糖颗粒的分类模型。结果显示可分为明显的2类，推断2种不同颗粒可能因所用生产工艺不同，其内在质量存在一定的差异。而这种差异可能来自野浸渍液单独提取与单独加入制备引起。野的乙醇单独提取有利于其黄酮类组分的渗出，造成质量的差异。同时，本研究通过标记物的筛选与鉴定，得到其中的3个化合物分别为异迷迭香酸苷、木犀草苷和蒙花苷。

该结果验证了前面推测的黄酮类组分可能是引起质量差异的主要组分。同时这3个化合物是文献中作为质控指标报道最多的物质之一，说明本研究的结果与文献的结果也基本一致。该结果对夏桑菊颗粒的多指标的质量控制具有重要意义。

[参考文献]

[1]中国药典.一部[S].2010： 263.

[2]林丽美，夏伯候，刘菊妍，等. RP-hplc法同时测定夏桑菊颗粒中绿原酸、异迷迭香酸苷、迷迭香酸和蒙花苷[J]. 中成药，2013，35（11）：2411.

[3]花汝凤，姚江雄，黎志坚，等. HPLC同时测定夏桑菊颗粒中迷迭香酸与异迷迭香酸苷的含量[J]. 中国实验方剂学杂志，2013，19（24）：75.

[4]黄淑彰. HPLC法测定夏桑菊颗粒中熊果酸的含量[J]. 现代中药研究与实践，2004（3）：33.

[5]彭丽英，彭攸灵，杨先国. RP-HPLC测定夏桑菊颗粒中迷迭香酸的含量[J]. 中国当代医药，2014，21（20）：8.

[6]Peng Q， Tian R， Chen F， et al. Discrimination of producing area of Chinese Tongshan kaoliang spirit using electronic nose sensing characteristics combined with the chemometrics methods[J]. Food Chem， 2015， 178： 301.

[7]Guo L， Duan L， Liu K， et al. Chemical comparison of Tripterygium wilfordii and Tripterygium hypoglaucum based on quantitative analysis and chemometrics methods[J]. J Pharmaceut Biomed Anal， 2014， 95： 220.

[8]Bevilacqua M， Marini F. Local classification： locally weighted-partial least squares-discriminant analysis （LW-PLS-DA）[J]. Anal Chim Acta， 2014， 838： 20.

[9]王[， 欧阳臻， 郭兰萍， 等. 苍术综合化学模式识别[J]. 中国中药杂志， 2014， 39（13）： 2536.

[10]沈莉， 赵燕燕， 谢洪平， 等. 升麻的1H-NMR 指纹图谱-模式识别研究[J]. 中国中药杂志， 2013， 38（2）： 217.

[11]Fukunaga K. Introduction to statistical pattern recognition[M]. New York：Academic press， 2013.

[12]Kurubanjerdjit N， Chen C Y， Tzeng K R， et al. In-silico study of the role of differentially expressed genes and microRNAs in host-pathogen interaction[C]. Hongkong：Proceedings of the International MultiConference of Engineers and Computer Scientists，2014.

[13]Bro R， Smilde A K. Principal component analysis[J]. Anal Method， 2014， 6（9）： 2812.

[14]Robins J. Partial-least squares[J]. Long Range Plann， 2012， 45（5）： 309.

[15]De Lucia F C， Gottfried J L. Influence of variable selection on partial least squares discriminant analysis models for explosive residue classification[J]. Spectrochim Acta Pt B-At Spec， 2011， 66（2）： 122.

[16]Boccard J， Rutledge D N. A consensus orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLS-DA） strategy for multiblock Omics data fusion[J]. Anal Chim Acta， 2013， 769： 30.