基于HK―2细胞的泽泻萜类组分体外肾毒性评价及其诱导细胞凋亡作用的探究
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[摘要]用人肾小管上皮细胞（HK-2）评价泽泻萜类组分的肾毒性作用，同时探究其诱导HK-2细胞凋亡的作用，为存在争议的泽泻肾毒性研究提供参考。采用肾小管上皮细胞株，运用 MTT 比色法测定细胞活力，流式细胞术分析细胞凋亡，同时用Western blot检测HK-2细胞 caspase-3，Bcl-2，Bcl-xl，Kim-1，clusterin，TFF-3蛋白表达水平，最后用q-PCR检测caspase-3，Bcl-2，Bcl-xl，Kim-1，clusterin，TFF-3 mRNA的表达。流式细胞仪检测结果表明，泽泻萜类组分（6.25×10-5，3.125×10-5，1.562 5×10-5 g・mL-1）给药组细胞凋亡率分别为（37.48±1.76）%，（26.91±1.91）%，（25.61±2.05）%。同时，Western blot结果说明泽泻萜类组分不同剂量给药组中Bcl-2和Bcl-xl蛋白水平都有显著地降低，而caspase-3蛋白水平显著地提高。q-PCR结果与Western blot结果一致，泽泻萜类组分不同剂量给药组中Bcl-2和Bcl-xl的 mRNA水平都有显著的降低，而caspase-3 mRNA水平有显著的提高。Western blot和q-PCR结果说明，泽泻萜类组分不同剂量给药组中细胞的clustrein，Kim-1和TFF-3蛋白表达和mRNA水平均有显著地提高。HK-2细胞系体外评价结果表明，泽泻萜类组分具有肾毒性作用，但是还需要进一步的研究证明，同时可诱导HK-2细胞凋亡，为泽泻肾毒性研究以及临床用药安全提供依据。
[关键词]泽泻萜类组分；HK-2细胞；细胞凋亡；肾毒性
泽泻为泽泻科多年生沼泽草本植物泽泻Alisma orientalis （Sam.） Juzep.的干燥块茎。块茎呈球形、椭圆形或卵形，表面黄白色或淡黄棕色，质坚实。泽泻是临床常用的一味中药，具有利尿、抗肾炎活性、降血糖血脂及抗动脉粥样硬化、抗肾结石形成、抗脂肪肝、对心血管系统及免疫调节等作用[1-4]。近年来，泽泻毒性报道越来越多，尤其以肾毒性为主，泽泻是否具有肾毒性一直存在争议，因此泽泻是否具有肾毒性还需要进一步的探索研究。
随着“马兜铃酸肾病”的出现，中草药肾毒性以及肾病逐渐受到国内外学者及医家的强烈关注，已成为医学界的争论焦点之一[5]。因此，中药及中药制剂的安全性日益引起人们的关注。泽泻在临床上有广泛的应用，通常认为泽泻是没有毒性的。研究者用富含三萜类的泽泻提取物喂养大鼠90 d，实验表明高剂量的泽泻提取物对大鼠没有明显的毒副作用[6]。但《中草药不良反应及防治》记录：泽泻“大剂量或长期应用，可致水电解质失衡以及血尿，甚至发生酸中毒”[7]。有研究表明，泽泻醇B对SK-OV3，B16-F10和HT1080肿瘤细胞有明显的毒性[8]。韩国研究者通过23-乙酰泽泻醇B合成泽泻中的其他三萜类化合物，提示这些化合物对B16-F10和HT1080肿瘤细胞也有明显的毒性[9]。同时，有研究认为长时间高剂量的使用泽泻会导致肝毒性或肾毒性[10]。
本实验针对前期泽泻肾毒性研究的争议，用HK-2细胞对泽泻萜类组分肾毒性作用进行体外评价，同时探索泽泻萜类组分诱导HK-2细胞凋亡作用，以期为泽泻肾毒性研究以及安全使用提供参考。
1材料
泽泻饮片（安徽井泉集团中药饮片有限公司，批号20140501），药材经南京中医药大学吴启南教授鉴定为对应种属药材。泽泻萜类组分（本实验室制备） 。DMEM高糖-F12（1∶1）不完全培养基购自南京凯基生物发展公司；胰蛋白酶，MTT[3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazoliumbromide]购自美国Sigma公司，MTT配制质量浓度为5 g・L-1，-20 ℃冰箱保存；胎牛血清（FBS）购自美国Gibco公司；AB-8大孔树脂购自沧州宝恩吸附材料科技有限公司；甲醇（色谱纯）和二甲基亚砜（DMSO）购自南京化学试剂有限公司。羊抗小鼠 IgG，羊抗兔 IgG，兔抗羊 IgG，考马斯亮蓝染色法检测蛋白试剂盒，TaKaRa反转录试剂盒和TaKaRa试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。
CO2培养箱（Thermo Electrom 公司）；生物安全柜（Labconco Purifier Class Ⅱ Biosafety Cabinet）；LDZX-50KB立式压力蒸气灭菌器（上海申安医疗器械厂）；Anke TDL-40B型低速大容量多管离心机（上海安亭科学仪器厂）；HH-60数显恒温搅拌循环水浴锅（国华电器有限责任公司）；微量移液器（Thermo，美国）；高速冷冻离心机（美国Beckman公司）；Milli-Q纯水机（美国Millipore公司）；全自动酶标仪（Thermo Electrom公司）；Western 电泳仪（Bio-Rad公司）；IX51型荧光倒置显微镜（Olympus， 日本）；XDS-1B倒置显微镜（重庆光电仪器总公司）；Agilent 1100高效液相色谱仪（Agilent，美国），Alltima C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；荧光定量PCR循环仪（ABI，美国）；凝胶成像仪（BIO-RAD Gel Doc XR，美国）。
肾小管上皮细胞株（HK-2）购自南京凯基生物发展公司。
2方法
2.1泽泻萜类组分的制备及表征
2.1.1泽泻提取浓缩泽泻粉碎，称取200 g泽泻粉末，以10倍量80%乙醇煮沸30 min，过滤液为1液；药渣加10倍量80%乙醇再煮沸30 min，过滤液为2液，合并1和2液，减压热浓缩至400 mL。
2.1.2分离纯化本实验用AB-8大孔树脂对泽泻萜类组分进行纯化[11]。取一定量的AB-8大孔树脂，加入95%乙醇浸泡48 h，使之充分溶胀，然后装柱（边加边搅拌缓慢加入）。接着用95%乙醇淋洗，直至流出液在试管中用等体积的水溶解后不再有浑浊的现象，最后用蒸馏水反复冲洗，直到没有醇味为止。对泽泻80%乙醇提取物分别用20%，40%，60%，70%，80%乙醇进行洗脱，得到不同梯度的洗脱液。
2.1.3样品及对照品的制备AB-8大孔树脂70%乙醇洗脱液，蒸干溶剂，烘干至恒重，精确称取泽泻洗脱物10 mg置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度线，即制得1 g・L-1的样品溶液。
精确称取环氧泽泻烯，泽泻醇F，泽泻醇A， 24-乙酰泽泻醇F，泽泻醇A-24-醋酸酯，泽泻醇G，25-甲氧基泽泻醇A，泽泻醇B，23-乙酰泽泻醇B，23-乙酰泽泻醇C对照品1 mg，置于10 mL量瓶中，定容，即制得0.1 g・L-1的对照品溶液。
2.1.4色谱条件[12]Alltima C18色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；流动相乙腈-水，洗脱梯度为0～5 min，0～2%乙腈；5～40 min，2%～35%乙腈；40～115 min，35%～98%乙腈；115～120 min，98%～100%乙腈。柱温25 ℃，流速1.0 mL・min-1，检测波长210 nm，进样体积10 μL。
2.2MTT比色法测定细胞活力
取对数生长期的肾小管上皮细胞（HK-2），将其消化后调整细胞密度为1×105个/mL，均匀接种于3块96孔板上，置于37 ℃，5%CO2的培养箱中培养24 h，吸去培养基，进行萜类组分干预实验：分别加入终浓度为1.0×10-3，5.0×10-4，2.5×10-4，1.25×10-4，6.25×10-5，3.125×10-5，1.562 5×10-5，7.812 5×10-6，3.906 25×10-6 g・mL-1泽泻萜类组分的不完全DMEM高糖-F12（1∶1）培养基100 μL，每个浓度均设6个复孔，该板置于37 ℃，5% CO2的培养箱中培养24 h后，每孔加入质量浓度为0.5 g・L-1的MTT 100 μL于37 ℃，5% CO2的培养箱中培养 4 h 后，吸去孔内培养基，每孔加入 100 μL 二甲基亚砜（DMSO） ，于37 ℃恒温振荡10 min，全自动酶标仪测定各孔吸光度A。根据MTT实验结果，计算细胞的存活率[13]。细胞存活率=（A细胞给药组-A给药组空白板）/（A细胞空白组-A空白组空白板）×100%，式中，A均为该浓度组的平均值。
2.3AnnexinV- FITC/PI双染法检测HK-2细胞凋亡
收集泽泻萜类组分实验组（6.25×10-5，3.125×10-5，1.562 5×10-5 g・mL-1）作用24 h及空白对照组的HK-2细胞，按照凯基AnnexinV-FITC/PI凋亡试剂盒说明，收集约5×105个细胞重悬于500 μL 1×Binding Buffer，依次加入AnnexinV- FITC 5 μL和PI 5 μL，室温避光孵育15 min，流式细胞仪检测凋亡率。
2.4Western blot检测HK-2细胞 caspase-3，Bcl-2，Bcl-xl，Kim-1，clusterin和TFF-3蛋白表达的影响
蛋白样品煮沸变性，进行电泳分离，浓缩胶电压80 V，30 min 后，分离胶电压调整至 100 V，约 90 min，电泳至溴酚兰离胶底部约 0.5 cm 时停止，取出凝胶，置于转移缓冲液中平衡 15 min，按恒流 200 mA 通电，电转移100 min进行转膜，NC 膜在5%脱脂奶粉封闭液中封闭（4 ℃，过夜） ，弃去封闭液，不洗。以1∶200 的比例稀释caspase-3，Bcl-2，Bcl-xl，Kim-1，clusterin，TFF-3和β-actin一抗，于摇床4 ℃ 摇荡孵育过夜，PBST 洗涤4次，每次10 min，以 1∶500稀释相应二抗，室温孵育4 h，PBST洗膜4次，每次10 min，按0.1 mL・cm-2显影液计算用量，将显影液加于NC膜上，室温放置1 min。用保鲜膜将膜包好（尽量避免气泡），X线胶片曝光显影。暗室中迅速将膜蛋白贴在X光胶片上曝光，洗片机中显影、洗像。调整曝光时间，直至出现最佳条带。以各组蛋白的表达量与内参照β-actin的比值作为其相对表达量。
2.5Real-time PCR检测caspase-3，Bcl-2，Bcl-xl，Kim-1，clusterin和TFF-3 mRNA表达
收集各组细胞（约1×107个），根据mRNA表达Trizol一步法说明提取细胞总RNA，测定其纯度及浓度。cDNA的合成根据TaKaRa反转录试剂盒说明合成。以GAPDH作为内参，引物由华大基因公司合成，引物序列见表1。按照TaKaRa试剂盒说明，选择10 μL的反应体系，包括SYBRPremix Ex Taq II （ 2X ） 5 μL cDNA模板0.8 μL，上下游引物（10 μmol・L-1 ）各0.4 μL，dH2O 3.4 μL。扩增条件：95 ℃预热30 s；95 ℃变性5 s，退火温度30 s，扩增39个循环；最后65 ℃延伸5 s；每组设3个复孔。以各组的基因的表达量与内参照GAPDH的比值作为其相对表达量。
2.6统计学处理
实验过程中所产生数据均采用 SPSS 16.0 进行处理，并且各组间数据比较采用t检验，用±s表示，P
3结果
3.1泽泻萜类组分表征
AB-8大孔树脂70%乙醇洗脱液中含有环氧泽泻烯，泽泻醇F，泽泻醇A，24-乙酰泽泻醇F，泽泻醇A-24-醋酸酯，25-甲氧基泽泻醇A，泽泻醇B，23-乙酰泽泻醇B。色谱图见图1，2。以峰面积分别计算上述萜类的含量，见表2，AB-8大孔树脂70%乙醇洗脱液中上述萜类的总质量分数为61.74%。
3.2MTT 比色法测定细胞活力
当细胞存活率大于95%时可认为药物对细胞无毒性，MTT结果表明，细胞存活率与泽泻萜类组分呈剂量依赖关系，当泽泻萜类组分质量浓度为6.25×10-5 g・mL-1时，细胞存活率为（95.18±1.94）%，与对照组生存率无显著性差异，即在此浓度时药物对细胞无显示细胞毒性，见表3，故选用6.25×10-5，3.125×10-5，1.562 5×10-5 g・mL-1用于后续实验研究。
3.3流式细胞仪检测HK-2细胞凋亡水平
流式细胞仪、PI双标法检测细胞凋亡率，见图3，结果显示，空白组细胞主要集中于左下LL区域，表明细胞存活率高，其凋亡率仅为6.63%；泽泻萜类组分（6.25×10-5，3.125×10-5，1.562 5×10-5 g・mL-1）给药组细胞存在于LL区域明显减少，大多存在于UR区域中，少数存在于LR区域中，表明细胞早期凋亡甚至死亡较多，后期凋亡较少；泽泻萜类组分（6.25×10-5，3.125×10-5，1.562 5×10-5 g・mL-1）给药组细胞凋亡率分别为（37.48±1.76）%，（26.91±1.91）%，（25.61±2.05）%，表明泽泻萜类组分（6.25×10-5，3.125×10-5，1.562 5×10-5 g・mL-1）可引起HK-2细胞产生凋亡，但不同剂量组之间无明显差异。
3.4泽泻萜类组分对HK-2细胞 caspase-3，Bcl-2，Bcl-xl，Kim1，clusterin和TFF-3蛋白表达的影响不同浓度的泽泻萜类组分作用于HK-2细胞24 h后，凋亡蛋白Bcl-2，Bcl-xl和caspase-3随着浓度的增加没有显著性差异，但是相比于空白组，泽泻萜类组分组（6.25×10-5，3.125×10-5，1.562 5×10-5 g・mL-1）给药组中Bcl-2和Bcl-xl蛋白水平都有显著的降低（P
与空白组相比，泽泻萜类组分（6.25×10-5，3.125×10-5，1.562 5×10-5 g・mL-1）给药组中细胞的Bcl-2，Bcl-xl，caspase-3，clustrein，Kim-1和TFF-3蛋白表达均有显著地提高（P
3.5泽泻萜类组分对HK-2细胞caspase-3，Bcl-2，Bcl-xl，Kim1，clusterin和TFF-3 mRNA水平的影响
为了进一步说明泽泻萜类组分可引起HK-2细胞的凋亡，本实验采用q-PCR对抗凋亡的Bcl-2，Bcl-xl和促凋亡的caspase-3的mRNA水平进行检测。与空白组相比，泽泻萜类组分（6.25×10-5，3.125×10-5，1.562 5×10-5 g・mL-1）给药组中Bcl-2和Bcl-xl的 mRNA水平都有显著的降低（P
为了进一步说明泽泻萜类组分可引起肾毒性作用，本实验采用q-PCR对相关指标clustrein，Kim-1，TFF-3的mRNA水平进行检测。与空白组相比，泽泻萜类组分（6.25×10-5，3.125×10-5，1.562 5×10-5 g・mL-1）给药组中细胞的clustrein，Kim-1，TFF-3的mRNA水平均有显著的提高（P
4讨论
泽泻成分分析研究表明，萜类成分是泽泻中主要的成分，研究表明，在泽泻萜类组分中，23-乙酰泽泻醇B，24-乙酰泽泻醇A，泽泻醇B是新型的自噬诱导剂，其中，泽泻醇B活性最强[14]。本实验中的萜类组分，除了含有23-乙酰泽泻醇B，24-乙酰泽泻醇A和泽泻醇B 3种萜类外，还含有其他5种萜类成分。针对23-乙酰泽泻醇B，24-乙酰泽泻醇A，泽泻醇B是自噬诱导剂，本实验室正在开展相关研究，以期探讨泽泻萜类的相关药理毒理作用。
吴启南等[15]研究23-乙酰泽泻醇B和24-乙酰泽泻醇A在大鼠体内0.5 h达到最高血药浓度且呈现明显的双峰，分析可能的原因是游离的泽泻醇能通过肾小球过滤进入肾小管，泽泻醇浓度上升，因为泽泻醇是脂溶性成分，可反向血浆扩散。基于此研究推测，如果泽泻具有肾毒性，可能与脂溶性泽泻醇含量减少有关，使泽泻醇在肾小管蓄积而产生毒性。肾脏是药物毒副作用的主要靶器官，由于肾近端小管拥有庞大的转运系统和丰富的生物转化酶，对外源性毒物的损害特别敏感，是近年来研究中药肾毒性可靠的细胞模型之一[16-17]。因此本实验利用肾小管上皮细胞（hk-2）对泽泻萜类组分进行肾毒性作用研究。
细胞凋亡涉及一系列蛋白，如caspase家族蛋白、Bcl-2家族蛋白、p53和survivin[18]。Bcl-2是凋亡分子机制研究的主要靶分子；Bcl-xl是Bcl-2家族的重要成员，在抑制细胞凋亡中发挥了重要作用[19]；caspase-3是caspase家族中的最重要的凋亡执行者之一，是细胞凋亡过程中的主要效应因子[20]。本研究通过 Western blot 检测了各组细胞 Bcl-2，Bcl-xl和caspase-3蛋白的表达量来探究泽泻萜类组分促凋亡作用，实验结果表明，泽泻萜类组分给药组细胞 caspase-3蛋白表达量与正常组比较显著增加，而Bcl-2和Bcl-xl蛋白表达量与正常组比较显著下降。q-PCR结果与Western blot结果一致，与正常组比较，给药组细胞 caspase-3 mRNA表达量显著增加，而Bcl-2和Bcl-xl mRNA表达量显著下降。
肾损伤分子1（Kim-1）是肾脏近曲小管上皮细胞一种跨膜糖蛋白[21]。Kim-1在正常肾组织中表达水平极低，但在肾损伤的情况下，可特征性升高，因此Kim-1可作为一种检测早期肾损伤的可靠生物学标记物[22-23]。本实验分别用Western blot和q-PCR检测Kim-1蛋白表达和mRNA水平，结果表明Kim-1蛋白表达和mRNA水平均有显著的提高。
丛生蛋白（clustrein）是包括α和β 2个亚单位的糖蛋白，具有很强的黏附力，在急性和慢性肾损伤和疾病中表达都增加[24-26]。丛生蛋白与肾脏再生有关系，当肾毒素、肾切除术后、多囊肝性肾病和肾细胞瘤引起的急性肾损伤时，丛生蛋白和Kim-1 一样，在肾损伤后的去分化肾细胞中 mRNA 表达量增加[27]。三叶因子（TFF-3）是一种小分子的多肽，表达于肠道和肾脏组织，但是越来越多的报道显示，高含量的TFF-3与肾损伤有关[28-29]。Western blot和q-PCR结果表明，clustrein，TFF-3蛋白表达和mRNA水平均有显著的提高。
Kim-1，clustrein和TFF-3作为评价肾毒性的新颖的生物标志物，越来越多的被关注。本实验采用Kim-1，clustrein和TFF-3作为评价肾损伤的指标，区别于传统的肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）。这些指标灵敏度高、特异性好、可靠性高，越来越多的被用于肾毒性的检测。本实验结果表明，泽泻萜类组分具有肾毒性作用，同时可诱导HK-2细胞凋亡，为泽泻肾毒性研究以及安全使用提供参考。
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