探索清毒片与养正片对u PA活力的影响

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【摘要】［目的］观察中药清毒片、养正片对白血病细胞upa活性的影响。［方法］SD大鼠24只，随机分为4组：空白组用生理盐水，清毒片组用清毒片，养正片组用养正片灌胃,化疗组用阿糖胞苷腹腔注射，观察含药血清对HL60uPA活性的影响。［结果］与空白对照组相比较，阿糖胞苷和清毒片、养正片药物血清对HL60细胞培养液上清中uPA的活性都有一定程度的影响，而以阿糖胞苷含药血清降低uPA活性的效果较好。［结论］清毒片、养正片的临床治疗作用可能与其降低患者体内白血病细胞uPA活性表达水平的作用有关。

【关键词】清毒片；养正片；白血病；HL60；uPA

1实验材料

1.1实验材料清洁级SD大鼠24只（购自广州中医药大学实验动物中心），人早幼粒白血病细胞株HL60（购自中山医科大学实验动物中心），清毒片、养正片生药饮片各1剂(购自广州中医药大学第一附属医院),10%胎牛血清（购自杭州四季青公司），完全RPMI1640培养液(sigma公司产品)，uPA活性检测ELISA试剂盒（ChemiconInternational,Inc.产品），计数板，盖玻片，96孔板，加样枪，可处理吸头，一次性注射器，试管，Ep管，玻璃毛细管，灌胃针头，血分析用抗凝管、烧杯等。

1.2实验仪器倒置显微镜（Olympus产品），细胞培养箱（NAPCOSeries5400CO2Incubator），-20℃冰箱（HUALINGBCD268WA）、离心机（上海产TDL5型），电热恒温水温箱（上海跃进医疗器械厂），全自动酶标仪(BIORADModel3550)，干燥皿，解剖台，高压锅，电炉等。

2实验方法

2.1分组与用药将清毒片、养正片生药饮片用水煎浓缩法处理备用。制备清毒片、养正片药物血清(在广州中医药大学实验动物中心进行)。分组：清洁级SD大鼠24只,体重210±20g，雌雄各半，随机分为4组：空白（O）组，清毒片（Q）组，养正片（Y）组，化疗（H）组。方法参照中药血清药理相关文献。

各组分别用相应药物灌胃3.5d，2次/d。用药如下：O组用生理盐水2ml，Q组用清毒片口服液2ml（9g/kg），Y组用养正片口服液2ml（10g/kg），H组用阿糖胞苷1ml（17.85mg/kg）腹腔注射，1次/天，共用4次。于最后一次灌胃后1～2h将大鼠用乙醚麻醉，毛细玻璃管双眼球后动脉取血2ml置抗凝管中。将样本3000rpm/min离心10min取血清1ml，置56℃灭活30min，4℃冷藏备用。

2.2细胞培养人早幼粒白血病细胞株HL60，用完全RPMI1640培养液加10%胎牛血清培养，置37℃，5%CO2培养箱，3～5d换液1次，倒置显微镜观察，待细胞生长旺盛（达指数生长期）后进行下一步实验。

2.3含药血清处理细胞取生长良好的HL60细胞，离心后弃上清，用RPMI1640培养液稀释混匀，计数后按每孔200μl，密度5000/孔（细胞浓度为2.5×104/L）铺板，同步培养24h，每孔加入含各组含药血清的RPMI1640培养液200μl，使含药血清的浓度为10%，每个浓度设3个复孔,刺激48h后分别沉淀各组细胞，取上清液进行uPA活性的ELISA检测。

2.4细胞uPA活性的ELISA测定（根据试剂盒说明书操作）向96孔反应板中分别加入40uluPA含药血清样本、空白对照上清液或uPA阳性对照,添加足够的去离子水使总体积为160μl。然后按试剂盒说明书进行操作，终止反应后立即在全自动酶标仪上405nm波长读取光密度值。

2.5统计分析以uPA活性测定试剂盒中所提供的6个浓度的uPA阳性标准品的浓度为横坐标，各浓度标准品所对应的OD值为纵坐标，绘制标准曲线，依据标准曲线确定各浓度含药血清组OD值所对应的uPA活性水平。运用Excel统计软件，采用计量资料的t检验对各组药物血清处理细胞上清的uPA活性对应OD数值进行比较。

3实验结果

实验结果显示，与空白对照组相比较，阿糖胞苷、清毒片和养正片药物血清对HL60细胞培养液上清中uPA的活性都有一定程度的影响，而以阿糖胞苷含药血清降低uPA活性的效果最好，清毒片含药血清次之。各组uPA活性对应光密度值变化情况见下表1。

与空白组对比，*P<0.05，与空白组对比，**P<0.01

4讨论

uPA是一种丝氨酸蛋白水解酶，参与纤溶过程。一些研究发现，培养的白血病细胞中有纤溶活化剂（PAs）的高表达。用HL60细胞作为AL细胞的模型研究细胞周围基质降解，证实丝氨酸蛋白酶以尿激酶前体的形式存在，基质金属蛋白酶9（MMP9）前体的活化依赖于纤溶酶原活化剂/纤溶酶系统，并可被抑肽酶抑制，而MMP9只在HL60细胞存在的条件下检测到。结果表明HL60细胞通过纤溶系统活化MMP9，而MMP9的活化促进了基质降解，增强了白血病细胞的侵犯能力。AML患者TFPI、PAP值异常增高。治疗后TF、TAT在AML患者中维持高水平；uPA、uPAR在未缓解者持续增高；出血严重者PAP、uPA显著升高。得出结论uPA、uPAR可作为部分AML预后判断的指标［6］。急性髓性白血病（AML）患者骨髓和血浆中uPA的浓度均高于正常人，并且发现白血病细胞主要表达uPA，而不产生tPA。

清毒片和养正片分别由清热解毒及扶正固本的中药组成，是广州中医药大学附属第一医院血液科专家制定，并长期用于各型白血病患者的中药复方制剂。在临床上，对于患者病情缓解和改善生存质量起到了良好的作用。本实验研究从含药血清作用方面，探讨了清毒片、养正片在体外对人急性早幼粒白血病细胞系HL60生长状态及uPA活性的影响，以便与临床研究结合起来，更好地解释这两种中药治疗AL的作用。同时更深入地了解AL疾病变化状态及中药作用途径。

通过uPA活性测定的ELISA实验，发现清毒片、养正片与阿糖胞苷含药血清，均具有降低HL60细胞上清中uPA活性的作用。且随着药物浓度增加，uPA活性单位OD值逐渐下降，药物浓度与uPA活性单位OD值二者呈正相关。清毒片、养正片对HL60细胞具有降低其产生uPA活性物质的作用。提示这两种药物的药效与其改变白血病细胞uPA活性的作用有关。