谷氨酰胺对烧伤“休克心”的保护作用研究
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摘要 目的：探讨谷氨酰胺对烧伤大鼠“休克心” 的保护作用。方法：90 只Wiatar大鼠随机分为对照组（A）、烧伤组（B）、Gln治疗组（C）。B 组和C 组造成30% 总体表面积Ⅲ度烧伤。在伤后3、6、12、24小时，动态检测心肌细胞线粒体内细胞色素C、SOD、MDA及GSH-Px水平。结果： 烧伤组大鼠伤后心肌线粒体细胞色素C、SOD、GSH-Px有不同程度下降，谷氨酰胺对上述指标下降有较好拮抗作用。伤后心肌线粒体MDA含量显著升高，谷氨酰胺对MDA升高有较好拮抗作用。结论：谷氨酰胺对烧伤后心肌线粒体的损伤具有很好的保护作用。
关键词：谷氨酰胺;烧伤;休克心;心肌细胞;线粒体
诸多研究显示，严重烧伤早期即出现心肌器质性损害。由于烧伤早期出现的心肌缺血缺氧损害，不仅引起心功能不全还可以诱发或使烧伤休克加重，成为烧伤早期缺血缺氧的重要启动因素之一，因此黄跃生等于2000年提出了“休克心”这一概念[1]。鉴于此，临床上开展对烧伤后“休克心”的防治研究具有非常重要的理论与临床意义。
近年来有研究表明，谷氨酰胺（glutamine，Gln）在烧伤营养中的作用已远远超出了传统非必需氨基酸的范畴。当机体处于烧伤、创伤、感染等应激状态时，机体发生一系列的代谢变化，需要补充外源性谷氨酰胺。谷氨酰胺作为肠道粘膜细胞代谢所必需的营养物质，能够促进胃肠道细胞增殖，维持免疫细胞的正常功能，提高烧伤、创伤的治愈率并且降低病死率。[2]。本研究中，我们将重点观察Gln对烧伤后心肌细胞线粒体的影响，以进一步阐明Gln保护烧伤“休克心”，维护心脏正常功能的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
健康成年Wistar大鼠90只，雌雄不限，体质量（220±30）g，由南华大学实验动物学部提供。随机分成3组，正常对照组（A组，n=10）、烧伤对照组（B组，n=40）和Gln组（C组，n=40）。分别观察伤前（ A 组） ，以及伤后3、6、12、24h四个时相点 （ B 组、C 组） ，每个时相点10只大鼠。
1.2 烧伤模型的制备
A组不予烧伤，其他2组大鼠烧伤前禁食12h，1%戊巴比妥钠（30mg/kg）腹腔注射麻醉，背部电推剃毛，置于92℃水浴中烫伤18秒，造成30%体表面积Ⅲ度烧伤（病理切片证实）。伤后按40ml/kg腹腔注射乳酸林格氏液进行液体复苏，创面涂以碘伏抗感染，每天2次。Gln组大鼠采用灌胃方式给予Gln 1.0 g / （ kg? d）。烧伤对照组给予同等剂量的甘氨酸， 使各组大鼠等氮、等热量。伤后动物自由进食，自由饮水。
1.3 心肌线粒体的制备
断头处死大鼠， 摘取心脏， 心肌线粒体的提取采用组织线粒体分离试剂盒（美国Pierce公司），操作按照试剂盒说明书进行。将新鲜的心肌组织（约50～100mg）置于已预冷的玻璃匀浆器中， 用眼科剪将心脏反复剪碎，直至剪成肉泥; 再加入800ml线粒体分离试剂A，小心匀浆约20次，将匀浆液转移至Eppendorf管中，再加入800ml线粒体分离试剂C，700g，4℃条件下，离心10min。取上清液在3000g，4℃条件下，离心15min。取沉淀加入500ml线粒体分离试剂C，在12000g，4℃条件下，离心5min。第三次离心后的沉淀即为心肌组织的线粒体。
1.4 心肌线粒体细胞色素C的测定
取两个比色杯，分别加入线粒体悬液适量，0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4），10%去氧胆酸钠及10mmol/L K3Fe（CN） 6，测定杯中加入连二硫酸钠，记录波长540～630nm 处的氧化-还原光谱，取540～ 550nm 光谱差计算细胞色素C含量。
1.5 心肌线粒体SOD、 MDA和GSH-Px和含量测定
SOD活性测定采用黄嘌呤氧化酶法，MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法，GSH-Px 活性测定采用二硫代二硝基苯甲酸比色法。具体操作方法按试剂盒说明书进行。
1.6 统计分析
数据用均数±标准差（用±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，所有数据采用SPSS 13.0统计软件分析。
2 结果
2.1 Gln对烧伤大鼠心肌线粒体细胞色素C水平的影响
与对照组比较，烧伤组心肌线粒体细胞色素C在伤后3、6、12及24 h均呈显著性降低，其中伤后12 h下降幅度最大，Gln治疗组心肌线粒体的细胞色素C在烧伤后3、6、12及24 h 均较烧伤组有明显升高，见表1。
表1 心肌细胞线粒体内细胞色素C水平（±s）
组别
伤后时间
t/h
细胞色素c水平
/μmo l? mg - 1PRO
对照组（A组）
0.53±0.04
烧伤组（B组）
3
0.35±0.03#
6
0.29±0.05#
12
0.27±0.02#
24
0.33±0.04#
Gln组（C组）
3
0.47±0.07*
6
0.42±0.05*
12
0.35±0.06*
24
0.41±0.06*
与对照组比较， #P < 0.05;与烧伤组比较，* P < 0.05
2.2 Gln对烧伤大鼠心肌线粒体SOD、 MDA、GSH - Px含量的影响
由表2可见，大鼠烧伤后心肌线粒体SOD、GSH - Px活性在伤后均呈显著性下降，MDA含量有不同程度的升高。与烧伤组比较，Gln治疗组SOD、GSH - Px活性明显升高，MDA含量显著降低。
表2 心肌线粒体内SOD、MDA及GSH C Px的含量（±s）
组别
伤后时间
t/h
SOD
/U? mg - 1
MDA
/nmol? mg - 1
GSH-Px
/U? mg - 1
对照组（A组）
712.5±106.2
3.5±0.8
18.5±5.7
烧伤组（B组）
3
493.5±78.5#
5.6±1.1#
12.2±4.9#
6
441.1±72.8#
8.3±1.5#
9.7±4.5#
12
458.7±83.3#
7.9±1.3#
12.1±4.7#
24
480.2±88.4#
6.5±0.9#
13.4±5.5#
Gln组（C组）
3
696.8±74.6*
4.1±1.2*
16.9±5.2*
6
660.5±80.4*
4.7±1.5*
13.2±4.4*
12
682.1±77.2*
4.2±0.9*
15.8±5.3*
24
692.1±84.5*
3.9±0.8*
17.1±6.2*
与对照组比较， #P < 0.05;与烧伤组比较，* P < 0.05
3 讨论
研究表明心肌损害在严重烧伤的早期就已出现， 由于心脏的特殊重要性， 其损害不仅可引起心功能不全，还可成为造成或加重全身其它组织器官的缺血缺氧损害的推手，因此，烧伤后“休克心”的研究则具备了其必要性与重要性。严重烧伤早期出现的心肌器质性损害，主要表现如下： 1.心功能降低：烧伤后，心脏脉搏量（SV） 、脉搏指数（SVI） 、心排出量（CO） 和心排血指数（ CI）均降低;2. 心肌力学指标降低：烧伤后，主动脉收缩压（AOSP） 、主动脉舒张压（ AODP） 、主动脉平均压（MAP） 、左心室收缩压（LVSP） 、左心室舒张末期压（ LVEDP） 、左心室等容收缩期压力最大上升/下降速率（± dp/ dtmax）等均有所下降;3. 心肌细胞结构受损：烧伤后，肌球蛋白Ca2+ - ATP 酶活性降低，而血中肌球蛋白轻链1（ CM- LC1） 和肌钙蛋白T（ TnT ） 明显升高。心肌肌膜下出现空泡， 基膜与质膜分离，基膜缺损或质膜断裂。光镜下可见心肌横纹模糊不清，随着病程进展，还可出现心肌间质水肿、肌纤维断裂 、线粒体肿胀甚至空化等现象。 烧伤后“休克心”的发病机制较为复杂，主要总结为以下几个方面：1.心肌缺
血再灌注损伤;2.心肌组织水肿;3.心肌细胞氧利用及能量代谢障碍;4.失控性炎症反应。
心肌细胞线粒体的含量较为丰富，线粒体是为生命活动提供能量的重要细胞器。当机体受到外界等诸多致病因素的影响时，如烧伤、创伤、感染等应激情况，可引起线粒体结构与功能的改变[3]。SOD 是体内重要的抗氧化酶，能够清除体内的氧自由基，保护机体细胞和组织免受自由基的损害，而SOD活力下降也预示着机体清除自由基的能力降低。GSH-Px在细胞内能清除过氧化物代谢产物，阻断脂质过氧化连锁反应，从而起到保护细胞结构和功能的作用。SOD、GSH-Px的水平下降，机体对氧自由基的清除能力降低，可导致机体出现严重的脂质过氧化反应，损伤组织细胞。MDA是脂质过氧化的分解产物，是反映组织氧化损伤水平的指标之一，MDA含量增高说明机体氧化损伤加重。
大量研究显示： 烧伤后早期发生心肌线粒体结构与功能损伤，损伤的心肌产生大量的氧自由基，线粒体SOD、 GSH-Px 为了清除过多的自由基而导致消耗增多、活性下降。体内自由基增多导致导致组织过氧化反应，使得线粒体内MDA 含量升高。MDA含量增高能够影响线粒体的电子传递和磷酸化过程，导致ATP 酶活性下降， 使ATP 合成减少，能量供应不足最终影响细胞的功能。本研究中，我们给予烧伤大鼠Gln 后，增强了心肌线粒体SOD 和GSH-Px 的活性， 降低了线粒体脂质过氧化产物MDA 水平， 从而保证了线粒体的正常氧化和产能功能，明显减轻烧伤后导致的心肌损伤。
线粒体另一个重要的功能是进行生物氧化和提供细胞生命活动所需的能量。细胞色素C 是一种结构松散的水溶性膜外周蛋白[4]，细胞色素C缺失或者功能障碍，会导致线粒体呼吸链电子传递中断，导致ATP生成减少，细胞生命活动所需能量不足;另外，呼吸链电子传递障碍所致氧化不全也会造成ROS生成增多，从而损伤组织细胞。本研究显示，烧伤后心肌细胞线粒体内细胞素C 水平明显降低，Gln能显著提高烧伤后大鼠心肌细胞线粒体细胞色素C水平，有利于线粒体的生物氧化进而起到保护细胞的作用。
谷氨酰胺是一种中性氨基酸，它是含量最丰富的游离氨基酸， 60% 的游离氨基酸是谷氨酰胺。Gln是目前临床上应用得非常广泛的营养制剂，它具有保护肠道粘膜、提高免疫力、促进蛋白质合成、促进伤口愈合、抗抑郁、抗衰老等多种功能。业界认为，Gln属于条件必需氨基酸， 更是一种特殊的药物，因为它不仅能够作为营养物质提供氮源，还能强化机体免疫系统和抗氧化反应，目前已应用于骨髓移植和AIDS的患者。但是Gln 本身具有其局限性，溶解度低、稳定性差，难以做为常规静脉制剂，使其在临床上作为常规的急救药物应用于烧伤早期心肌损害的防治受到了限制，因此我们后续的研究有待进一步解决相关问题。
参考文献： 黄跃生，杨宗城，迟路湘，等. 烧伤后“ 休克心”的研究[J].中华烧伤杂志，2000，16（5）：275-278. 陈蕾，王玉莲. 谷氨酰胺与烧伤[J].医学综述，2007，13（21）：1664-1666. 万福生，李国辉，章洁，等. 牛磺酸对烫伤大鼠心肌线粒体成分和酶活性的保护作用[J].中华烧伤杂志，2008，24（3）：171-174. 邱振中，李锐，魏振雪. 丹参对烧伤大鼠心肌细胞线粒体功能影响的实验研究[J].中华烧伤创疡杂志，2003，15（2）：87-89.
[1] 通讯作者：王汉群，男，1971年10月生，湖南娄底人，副教授，研究方向：烧伤并发症的防治。