缬沙坦干预心肌梗死大鼠心室重构的实验研究*
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【摘要】 目的 探讨缬沙坦在心肌梗死后大鼠心室重构的作用机制。方法 结扎大鼠冠状动脉复制急性心肌梗死模型和充血性心力衰竭的大鼠动物模型；TUNEL法检测心肌细胞凋亡，用SP免疫组织化学方法染色检测心肌Bax蛋白表达。结果 心肌梗死大鼠凋亡心肌细胞数明显增多，其促凋亡基因Bax蛋白表达较对照组亦明显增强，尤其是急性期呈高表达（P＜0.01）；缬沙坦干预虽能抑制部分Bax蛋白的表达量，但仍明显强于对照组（P＜0.05）。结论 心肌细胞凋亡与其Bax表达过高有关；缬沙坦可能通过阻断血管紧张素Ⅱ而部分抑制心肌梗死时心肌细胞凋亡的发生，从而减轻或逆转心室重构。 【关键词】 心肌梗死；心室重构；凋亡；Bax蛋白；缬沙坦
Experimental study on myocardial remodeling interfered with valsartan in myocardial infarction of rats
【Abstract】 Objective To determine potential mechanisms of the valsartan to cardiomyocyte apoptosis and Bax protein expression in myocardial infarction of rats.Methods Animal model of acute myocardial infarction were established by ligating the left anterior descending coronary artery of rats，myocyte apoptosis were estimated by terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end-labeling (TUNEL)，Bax protein expression of myocardium were semi-quantified by SP immunohistochemistry.Results Cell necrosis was the main manifestation in early stage，and then gradually increased the number of apoptotic cells and positively correlated to the expression of Bax protein，especially in acute stage (P＜0.01)；valsartan inhibited its expression to some extend (P＜0.05).Conclusion In infarcted myocardium，cardiomyocyte apoptosis is positively correlated to Bax protein expression，and they can be suppressed but not fully suppressed by the angiotensin II(Ang II) type 1 receptor blocker-valsartan.Valsartan can inhibit Ang Ⅱ and reduce the numbers of apoptotic cardiomyocyte.It is probably one of the mechanisms of the myocardial remodeling decreased by valsartan.
【Key words】 myocardial infarction；myocardial remodeling；apoptosis；Bax protein；valsartan
心室重构是发生充血性心力衰竭(CHF)的病理基础，其中心肌纤维排列紊乱、心肌细胞的丢失以及纤维结缔组织的增生是参与心室重构的主要病理过程。心肌细胞丢失包括细胞坏死和细胞凋亡。近年来心肌细胞凋亡在心肌缺血再灌注时的变化已有报道［1''2］但在由急性心衰向慢性心衰的转变过程中，心肌细胞丢失的时域改变以及血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（angiotensin II receptor blockers，ARBS）—缬沙坦(valsartan)干预后的情况如何，目前尚不太清楚。本实验通过结扎大鼠冠状动脉前降支建立大鼠心肌梗死模型致大鼠心室重构，观察心肌梗死后发生心室重构的过程中心肌细胞凋亡和促凋亡基因Bax蛋白表达的时域变化规律及缬沙坦对其的影响，以明确缬沙坦在干预心肌梗死后心室重构中的作用。
1 对象与研究
1.1 研究对象 2～3个月龄健康Wistar雄性大鼠（中国人民第三军医大学大坪医院动物科学实验中心提供），重150～200g。
1.2 主要试剂 原位细胞凋亡检测试剂盒（BM公司）；蛋白酶K（Promega公司）；Triton X-100（Sigma公司）；DAB（BM公司）；Bax抗体（Santa Cruz公司）；SP免疫试剂盒（北京中山生物技术公司）；缬沙坦（诺华制药公司）。
1.3 实验设计与分组 结扎左冠状动脉前降支复制大鼠心力衰竭模型。假手术组：大鼠20只，缝线未结扎冠状动脉；心力衰竭（心衰）组：大鼠80只，分冠状动脉结扎后24h、1周、4周、8周不同时相点；缬沙坦组：大鼠60只，结扎冠状动脉后第2天开始管饲法给予缬沙坦30mg/（kg·d），时相点同心衰组。
1.4 血流动力学及常规病理学检测 各组大鼠在观察终点行血流动力学检测及心脏常规固定做病理学检测。
1.5 心肌细胞凋亡的原位检测 凋亡细胞的原位检测：应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）标记心肌凋亡细胞核中的DNA 3’-OH末端，用TUNEL POD法显示凋亡细胞。按试剂盒说明进行。凋亡细胞计数分析：正常心肌细胞核呈蓝色，而凋亡阳性细胞核为棕黄色。在光镜（日本Olympus）下于心肌梗死周边区计数5个高倍视野（HPF，400×）中阳性心肌细胞核数，求均值。
1.6 Bax蛋白表达 用SP免疫组织化学方法染色检测［3］。
1.7 图像分析 采用Tiger 920细胞图像分析仪及其软件分析组化图像。在显微镜（200×）下以相同的外部条件（亮度）摄取bmp图像，每张切片摄10幅，设定灰度阈值50～250。得到统计场总面积的吸光度值（A value），每张切片取均值。
1.8 统计学方法 资料以均数±标准差（x±s）表示，各组间采用t检验分析或q检验，P＜0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 手术后4周各组大鼠血流动力学指标 见表1。
表1 各组大鼠血流动力学变化 （x±s）
注：SO(sham-operation group)，假手术组；CHF(congestive heart failure group)，心力衰竭组；ARB(valsartan therapy group)，valsartan治疗组。每组随机抽选8只大鼠。MAP，平均动脉压；LVDP和LVSP；左室舒、缩压；+dp/dt max，左室等容收缩期室内压力上升最大速率；-dp/dt max，左室收缩后室内压下降最大速率。与SO比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与ARB组比较，P＜0.05
2.2 病理改变 与假手术组比较，大体结构见心梗组（4周内）未梗死心室壁和室间壁明显增厚，心衰组在心衰后期心腔明显增大，心室壁明显变薄，以陈旧性梗死区最明显且苍白。缬沙坦治疗组心肌梗死面积较心衰组明显缩小，心腔大小及室壁厚度较心衰组明显改善。
2.3 心力衰竭心肌细胞凋亡的变化规律 心衰组凋亡阳性细胞核呈黄褐色颗粒状，位于凋亡细胞核内，阳性物定位准确、背景清晰。缬沙坦组在冠脉结扎急性期和心衰代偿期心肌凋亡阳性细胞核染色和心肌坏死的改变与心衰组基本相似，但结扎冠脉后期（8周以后）阳性染色核明显少于心衰组。见表2。
表2 心衰不同时期心肌细胞凋亡情况 （x±s）
注：与SO组比较， *P＜0.05，**P＜0.01；与CHF 8周组比较，P＜0.05，P＜0.01
2.4 心力衰竭心肌细胞Bax蛋白表达的变化 SP免疫组化染色后，Bax蛋白阳性呈棕黄色颗粒，位于细胞膜及细胞质内，甚至覆盖整个细胞。各手术组急性期Bax蛋白均呈强阳性表达，随着时间的推移，Bax蛋白表达有所减弱；在心衰组后期一部分心肌细胞仍可见Bax蛋白阳性表达，表达相对较弱；缬沙坦组在冠脉结扎8周后在陈旧性梗死区及周边心肌细胞Bax蛋白表达较同期心衰组明显减弱；急性期和代偿期与同期心衰组比较Bax蛋白表达无明显差异。见表3。Bax蛋白表达量与心肌细胞凋亡数呈明显正相关（y=-231+0.042x，r=0.6503，P＜0.01，n=20）。
3 讨论
充血性心力衰竭是大多数心脏疾病患者的最终结果，严重威胁着人们的健康；其机制研究是心血管疾病临床和基础工作者探索的热点。心力衰竭发生的病理生理过程中，循环肾素血管紧张素系统（RAS）起重要作用，尤其局部RAS可能对靶器官的影响更为重要［4，5］。RAS的主要效应分子AngⅡ是为心肌肥大刺激因子，可使心肌细胞内Ca2+流动发生改变，在钙调神经磷酸酶（CaN）等Ca2+敏感酶系的介导下，通过对一系列转录因子的活化而实现对基因转录的调节，从而使细胞表型发生改变以适应环境，即通过一系列的信号转导最终导致心肌肥大［4］。病理检查发现，随心功能恶化，CHF患者心肌纤维走向紊乱。早期代偿性肥大细胞变性、心肌组织肌丝断裂、溶解、坏死及凋亡心肌。晚期间质胶原结缔组织明显增生。
表3 免疫组化图像分析结果（x±s，单位：统计场总面积的IOD值）
注：与SO组比较，**P＜0.001；与CHF组比较，P＜0.05
心肌梗死后由于缺血缺氧以及体内神经体液因子的改变致使心肌细胞发生凋亡和坏死，基质及纤维组织增生而发生心脏重构和心力衰竭。心肌梗死时RAS激活，导致循环及局部血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）增加，AngⅡ可诱导细胞凋亡，其中心脏组织局部AngⅡ明显增加对心肌细胞的增殖、肥大及纤维组织增生起着重要作用。因此，从理论上而言，血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（ARBs）是阻断AngⅡ的最佳选择［5］。但Staessen和Verma等［6，7］均认为在高血压、心力衰竭、糖尿病、肾功能衰竭等高危患者群中应用ARBs可能会增加患者发生心肌梗死的风险。这可能与长期阻断1型血管紧张素Ⅱ（AT1）受体，导致2型血管紧张素Ⅱ（AT2）受体过度刺激有关［8］。AT2受体的过度刺激对扩张血管、抑制肥厚和纤维化有益处，但也有其副作用，可能触发细胞凋亡、抑制血管再生［8］。有学者认为，抑制纤维增生可使纤维帽变薄导致粥样斑块不稳定破裂进而发生心肌梗死的风险增加［9］。但Verdecchia［10］在一项随机对照研究中发现用ARBs治疗后并不增加心肌梗死的风险。本实验发现：在心衰组心肌促凋亡的Bax蛋白呈强阳性表达，主要位于梗死区及其附近，而远离梗死区的心肌Bax蛋白表达明显减少。在心肌梗死后期缬沙坦治疗组Bax表达较心衰组有所下降，但仍未恢复至正常，这可能与缬沙坦阻断部分AngⅡ的细胞毒作用，减轻心肌细胞的损伤有关。缬沙坦可通过阻断AngⅡ受体而使AngⅡ对心肌细胞作用减弱，缓解心力衰竭症状。
因此，缬沙坦阻断AngⅡ和减少细胞凋亡可能是逆转心室重构的机制之一。
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6 Staessen JA，Thijs L，Birkenh ger WH. Value：analysis of results.Lancet，2004，364：931.
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9 Levy BI. Can angiotensin Ⅱ type 2 receptors have deleterious effects in cardiovascular disease? Implications for therapeutic blockade of the renin-angiotensin system. Circulation，2004，109：8-13.
10 Verdecchia P，Angeli F，Gattobigio R，et al. Do angiotensin Ⅱ receptor blockers increase the risk of myocardial infarction? European Heart Journal，2005，26：2381-2386.