中国汉族人群Megsin基因变异与部分多态性位点鉴定

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作者：夏运风，李幼姬,黄霜，黄伟俊，薛超，杨念生，黎嘉能，Patrick H Maxwell，王一鸣

【关键词】 肾小球肾炎

Genovariation and identification of some polymorphism loci of Megsin gene in Chinese Han population

XIA YunFeng, LI YouJi, HUANG Shuang, HUANG WeiJun, XUE Chao, YANG NianSheng, Lai Kar N, Patrick H Maxwell, WANG YiMing

1Department of Nephrology, First Affiliated Hospital, 2Department of Medical Genetics, Sun Yatsen University, Guangzhou 510080, China, 3Department of Internal Medicine, Queen Marry Hospital, University of Hong Kong, Hong Kong, China, 4Department of Medicine, Hammersmith Hospital, Imperial College, London, UK

【Abstract】 AIM: To investigate the genovariation of Megsin in Chinese Han population and to identify some single nucleotide polymorphism (SNP) suitable for the association study in IgA nephropathy (IgAN). METHODS: SNPs of Megsin gene were chosen from different functional regions according to GenBank. Their genotypes in IgAN patients and normal controls were determined by polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism (PCRRFLP) and direct sequencing. Heterozygosity of each SNP was calculated and compared between IgAN patients and normal controls. RESULTS: In the 12 SNPs chosen from GenBank, 6 were confirmed with polymorphism and 6 were found not with polymorphism. Two novel SNPs were found in the fifth intron of Megsin gene by direct sequencing. In 8 SNPs, 3 were with heterozygosity, less than 10% and 5 more than 10%, but no statistical difference was found in heterozygote percentages between IgAN patients and normal controls（P>0.05）.CONCLUSION: There is much difference in genovariation of Megsin between Chinese Han population and Caucasian population, which may be associated with the high incidence of IgAN in Chinese Han population.

【Keywords】 megsin; variation (genetics); glomerulonephritis, IgA; Han nationality; China; polymorphism, single nucleotide

【摘要】 目的： 了解中国汉族人群megsin基因变异，并对部分多态性位点进行鉴定，筛选适合IgA肾病相关研究的多态性位点. 方法： 从基因库中挑选部分Megsin基因不同功能区域的单核苷酸多态性(SNP)位点，应用聚合酶链式反应限制性片段长度多态性（PCRRFLP）和直接测序的方法，鉴定IgA肾病患者和正常对照组各位点基因型，计算各位点杂合度，根据杂合度大小和疾病组与正常对照组杂合度的差别，筛选适用于IgA肾病相关研究的多态性位点. 结果： 在12个从基因库挑选的SNP位点中，6个在我国汉族人群中未发现具有多态性，6个具有多态性. 在第5内含子发现两个新的SNP位点. 在8个确实具有多态性的位点中，3个属少见多态，5个属常见多态，各SNP位点杂合度在IgA肾病组和正常对照组差异无显著性（P>0.05）. 结论： 中国汉族人群Megsin基因变异与基因库中高加索人群存在较大差异，这可能与中国汉族人群对IgA肾病的高发病率具有重要联系.

【关键词】 Megsin；变异（遗传学）；肾小球肾炎，IgA；汉族；中国；多态性，单核苷酸

0引言

Megsin是一种在肾脏系膜细胞优势表达的基因，在IgA肾病、糖尿病等以系膜细胞增生、系膜基质积聚为主要病理改变的肾脏疾病中，其基因与蛋白表达水平均显著上调［1-2］，Megsin转基因小鼠出现与人类IgA肾病相似的肾脏病理改变［3］. 我们以往的研究发现，Megsin基因3′端非翻译区C2093T和C2180T多态性与中国汉族人群IgA肾病的发生显著相关［4］.

我国汉族人群是IgA肾病的高发人群，其发病率占肾活检人数的30%～40%［5-6］，而高加索人群如英国、加拿大和美国白人的发病率明显低于我国汉族人群，在美国仅占肾活检总数的2%～10%［7］. 本研究旨在了解中国汉族人群Megsin基因变异与基因库中高加索人群的差异，并初步筛选适合IgA肾病相关研究的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorthysm, SNP）位点，为最终阐明Megsin基因在IgA肾病发生、发展中的作用提供依据.

1对象和方法

1.1对象

中国汉族IgA肾病患者471例均系我院及香港大学玛丽医院(1997～2004)收治的住院或门诊患者，其中男193例，女278例，均符合WHO关于IgA肾病的诊断标准［8］. 年龄及性别匹配的广东地区既往无肾脏病及其他系统性疾病病史的汉族、健康自愿者200例作为正常对照组.

1.2方法

收集IgA肾病患者一般临床资料，在患者知情同意的情况下，每名患者及正常对照者抽取外周静脉血2～5 mL, EDTA抗凝. 基因组DNA抽提采用QIAamp DNA kit（QIAGEN, 德国），严格按照试剂盒说明书操作. 从基因库中调取Megsin基因序列及SNP信息（bioinfo. weizmann. ac.il, GenBank ID AF027866），在Megsin基因7个内含子和唯一一个在基因库中显示有SNP位点的外显子（第8外显子）中挑选12个要筛选的位点，随机选取IgA肾病和正常对照标本各50份，应用聚合酶链式反应限制性片段长度多态性（polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism, PCRRFLP）和直接测序的方法对各位点的基因型进行鉴定.

PCR反应的条件及反应混合物中各成分的浓度，根据位点和引物的不同进行适当调整，各位点所用引物及限制性内切酶（见表1）. 实验中用于测序的上下游引物分别为5′GGGCCTAGAAAGTGCTGGACACA3′和5′CAAGACACGTTTGGTGGTGTTTCA3′，其PCR产物长521 bp,测序步骤如下： 纯化的DNA模板20 ng, BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit mix(Applied Biosystems, 美国)2 μL，测序引物（同PCR引物）10 μmol/L组成8 μL反应体系进行PCR测序. 反应条件： 98℃ 1 min, 96℃ 30 s, 50℃ 30 s, 60℃ 4 min，25个循环. 3 mol/L乙酸钠（pH 5.2）和无水乙醇沉淀扩增的DNA，再用750 mL/L的乙醇洗涤1次，然后加入18 μL模板变性剂. 测序模板在95℃水浴5 min，立即置于冰水中5 min 将其淬灭成单链，转移至测序管，在ABI3100全自动序列分析仪上进行毛细管电泳测序.表1Megsin基因各SNP位点鉴定所用引物和限制性内切酶（略）

统计学处理: 应用SPSS13.0软件做统计分析，组间杂合度的比较采用χ2检验，P<0.05为有统计学意义.

2结果

IgA肾病患者肾穿刺时年龄(31.2±8.7)岁，病史(21.4±35.8) mo，其他临床指标分别为： 收缩压(116.8±17.5) mmHg (1 mmHg=0.133 kPa)，舒张压(76.4±45.1) mmHg，尿蛋白(0.95±1.78) g/d, 血肌酐(98.7±90.7) μmol/L, 血胆固醇(5.60±3.23) mmol/L,血甘油三酯(1.40±1.15) mmol/L.

在从基因库中挑选的12个位点中，9个应用PCRRFLP方法进行基因型鉴定，另3个位点距离较近，用直接测序的方法做基因型鉴定. IgA肾病患者和正常对照者部分多态性位点基因型鉴定的电泳图和测序图（图1）. 通过测序我们发现23103和23179是基因库及文献未见报道的新的多态性位点. 位点4265, 13074, 17643, 24515, 28950, 29770虽在基因库中显示为多态性位点，但在我们的实验中无论在IgA肾病患者还是在正常对照者均只发现一种基因型. 在8个多态性位点中，20808属少见多态，22895, 23103, 23167, 23179, 23381, 23415, 25663均属常见多态. 各多态性位点杂合度在IgA肾病组和正常对照组之间差异无显著性(P>0.05，表2).表2IgA肾病患者和正常对照各位点主要基因型及杂合度比较（略）

3讨论

IgA肾病在不同地区和种群中的发病率存在很大差异. 亚洲和黄种人整体上是IgA肾病的高发地区和高发人群，但同属亚洲的印度其发病率则明显低于我国［9］. 中国汉族人群IgA肾病的发病率明显高于高加索人群［5］. 在非洲，黑人IgA肾病的发生甚至非常罕见［10］. 这些流行病学资料显示，该病的发生与环境因素和不同人群的遗传背景密切相关.

Megsin是IgA肾病相关基因研究中的一个重要侯选基因，本实验运用PCRRFLP和直接测序的方法对14个Megsin基因的SNP位点进行了鉴定和筛选，结果发现，有六个基因库中的SNP位点在我们实验中未证实具有多态性，并发现两个新的多态性位点. 由于现有基因库中的遗传资料主要来自高加索人群，我们的实验说明，高加索人群与我国汉族人群在Megsin基因的遗传变异上存在着较大差异，这可能与我国汉族人群对IgA肾病的高易感性具有重要联系，也为我们今后的研究指明了方向.

SNP是目前最重要的遗传标记，与微卫星DNA相比，它具有含量丰富、稳定性高、易于高通量分析的特点. 根据其在人群中的分布频率可分为少见多态（频率低于5%）和常见多态（频率大于10%）. 前者常常只存在于部分人群中，代表了人群的“特性”，而后者多见于所有人群中，代表了人群的“共性”. 本实验中发现的两个新的SNP位点为人类SNP数据库的丰富和中国汉族人群SNP图谱的构建积累了有价值的资料.

我们对中国汉族人群IgA肾病患者和正常对照者Megsin基因部分多态性位点的杂合度进行了比较，结果发现在8个已证实的多态性位点中两者的杂合度无显著性差异，而高加索人群上述多态性位点的杂合度目前尚未见报道. 杂合度是SNP标记的重要遗传学参数， Megsin基因各SNP位点杂合度的检测与比较对后续研究具有重要的参考价值. 杂合度较低时，则后续研究的样本量可能需要很大，杂合度较高时，则在有限的样本中更易发现阳性的结果. 杂合度在正常对照组和疾病组的差异更可直接提供该SNP位点与疾病相关的信息.

我们的研究显示，中国汉族人群Megsin基因变异与高加索人群存在较大的差异，这可能与中国汉族人群对IgA肾病的高易感性密切相关.

【参考文献】

［1］ Miyata T, Nangaku M, Suzuki D, et al. A mesangiumpredominant gene, megsin, is a new serpin upregulated in IgA nephropathy ［J］. J Clin Invest, 1998,102(4):828-836.

［2］ Suzuki D, Miyata T, Nangaku M, et al. Expression of megsin mRNA, a novel mesangiumpredominant gene, in the renal tissues of various glomerular diseases ［J］. J Am Soc Nephrol, 1999,10(12):2606-2613.

［3］ Miyata T, Inagi R, Nangaku M, et al. Overexpression of the serpin megsin induces progressive mesangial cell proliferation and expansion ［J］. J Clin Invest, 2002,109(5):585-593.

［4］ Li YJ, Du Y, Li CX, et al. FamilyBased association study showing that immunoglobulin A nephropathy is associated with the polymorphisms 2093C and 2180T in the 3' untranslated region of the Megsin gene ［J］. J Am Soc Nephrol, 2004,15(7):1739-1743.

［5］ Lin SY. Nephrology in China: A great mission and momentous challenge ［J］. Kidney Int, 2003,63(S83):S108-S110.

［6］ 陈惠萍,曾彩虹,胡伟新,等. 10594例肾活检病理资料分析［J］. 肾脏病与透析肾移植杂志, 2000, 9(6):501-509.

［7］ Donadio JV, Grande JP. IgA nephropathy ［J］. N Engl J Med, 2002,347(10):738-748.

［8］ Habib R, Niaudet P, Levy M. SchonleinHenoch purpura nephritis and IgA nephropathy ［A］//Tisher C, Brenner BM. Renal Pathology ［M］. Philadelphia: Lippincott. 1994:472-523.

［9］ Levy M, Berger J. Worldwide perspective of IgA nephropathy ［J］. Am J Kidney Dis, 1988,12(5):340-347.

［10］ Hsu SI, Ramirez SB, Winn MP, et al. Evidence for genetic factors in the

development and progression of IgA nephropathy ［J］. Kidney Int, 2000,57(5):1818-1835.