金银花小鼠血清移行成分指纹图谱研究
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【摘要】 目的以小鼠为研究对象，进行金银花血清药物化学成分研究。方法以正常健康小鼠为研究对象，以高效液相色谱法测定血清药物化学成分图谱。结果血清药物化学成分图谱与金银花药材对照图谱比较，绿原酸经口服后吸收迅速，代谢较快，血药浓度2 h后就下降到不足30 min的20%；6，7号峰成分吸收入血后，代谢较慢，血药浓度维持时间长；9号峰成分吸收入血较慢，代谢也较慢，2 h后血药浓度不下降，反而有所上升； s峰（绿原酸峰），5，9，10，17，18，19号等在金银花药材中含量较高的峰，吸收入血的比例相对较低，而6，7号峰的吸收入血的比例相对较高。结论该文首次应用高效液相色谱法进行金银花小鼠血清药物成分图谱研究，方法稳定可靠，重现性好，能够全面反映金银花经胃给药吸收入血药物成分的变化，为建立金银花的谱效关系模型，确定金银花的药效物质与代谢作用机制奠定基础。
abstract：objectiveto study the pharmacochemical ingredients of serum, which taken from mouse administered the extract of flos lonicerae. methodsto take healthy mouse as research object, and determine the chromatogram of serum pharmacochemical ingredient by hplc. resultsby comparing the chromatogram of serum with which of extract of flos lonicerae, the result indicated that caffeotannic acid was absorbed and removed quickly in stomach, its blood level went down to 20% of which after half an hour within two hous, ingredients of peak 6 and peak 7 removed slowly after they were absorbed into blood, the blood drug level kept steady for a long period of time; ingredient of peak 9 was absorbed and removed slowly, after administration for two hours, the blood drug level did not go down but went up a little. the ingredients of main peaks of chromatogram of the extract of flos lonicerae such as peak s(caffeotannic acid), peak 5, peak 9, peak 10, peak 17, peak 18, peak 19 were absorbed into blood in a low proportion, but those of peak 6 and peak 7 had a higher proportion. conclusionthe chromatogram of pharmacochemical ingredient of serum of mouse by hplc is studied for the first time. the method is stable and dependable, and reproducible. the chromatogram can show all the changes of ingredients of the extract of flos lonicerae before and after they are absorbed into blood, which would base for establishment of the relationship model between fingerprint and pharmacodynamics, for ascertainment of pharmacodynamic substance and metabolism mechanism.
key words：flos lonicerae japonicae; serum pharmacochemistry; fingerprint
金银花flos lonicerae japonicae为忍冬科植物忍冬lonicera japonica thunb.的干燥花蕾或带初开的花。是临床大宗常用中药，具有清热解毒，疏散风热之功效，用于痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热等证。现代药理研究表明，本品具有明显的抗菌、抗病毒、抗炎作用。金银花含有以绿原酸为代表的咖啡酰喹宁酸类和以木犀草苷为代表的黄酮类成分，其中以有机酸类化合物含量最高。绿原酸体外抗菌抗病毒结果表明，有机酸类是金银花清热解毒的主要物质基础，尚没有直接的体内药理、药化实验证据。本文首次对金银花小鼠血清药物化学成分进行系统研究，旨在分析金银花药物成分在小鼠体内吸收代谢机制，建立谱效关系模型，确认金银花主要药效成分。
1 仪器与材料
1.1 仪器设备
离心机（lgr16-w，北京医用离心机厂）；高效液相色谱仪（agilent 1100型）；检测器（agilent dad 1050型）；agilent chemstation；中药色谱指纹图谱相似度评价软件（国家药典委员会）；超声波清洗器（kq2200，昆山市超声仪器有限公司）。
1.2 原料与试剂
金银花药材（产地山东平邑，购自安徽亳州中药材市场, 由山东中医药大学石俊英教授鉴定到种）；绿原酸对照品（批号110753-200413）由中国药品生物制品检定所提供；乙腈（天津四友生物医学技术有限公司）；医用酒精（济南酒精总厂，浓度95%）；其他试剂均为分析纯。
1.3 动物 雄性小鼠
［昆明种，spf级，山东中医药大学实验动物中心提供，合格证号： syxk(鲁)20050043］。
2 方法
2.1 金银花提取液的制备 取金银花100 g，加入50%乙醇回流提取2次，每次10倍量，放冷，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味，加水稀释成每毫升相当于0.5 g原药材的溶液（200 ml），即得。
2.2 给药与取血一次性给药后取血清进行分析，可以尽快的观察到药物主要成分入血的情况及药物成分在体内变化的趋势，但得到的血清中药物成分的含量低，测定有难度；多次给药后取血清分析，血清药物成分含量较高，易于测定，可观察稳态血药成分的特点，但对药物的代谢变化提供信息较少。本文将这两种给药方式结合应用，对照分析。
一次性给药：取体质量20 g左右的雄性小鼠共30只，实验室适应饲养3 d，然后以每千克体重15 ml的剂量灌胃给予金银花提取液，其中3只小鼠给予相同剂量的蒸馏水作为空白对照；其余27只小鼠分为3组，分别在给药后30 min，1 h，2 h后腹腔注射0.2 ml 10%水合氯醛麻醉，下腔主静脉取血0.5 ml。空白组同样操作。
多次性给药：取体质量20 g左右的雄性小鼠共12只，实验室适应饲养3 d，第4天开始，以每千克体重15 ml的剂量灌胃给药，其中9只给予金银花提取液，另3只给予同等剂量的蒸馏水，3次/d，第9次给药后1 h，小鼠腹腔注射0.2 ml 10%水合氯醛麻醉，于下腔主静脉取血0.5 ml。空白组同样操作。
2.3 供试溶液的制备将取出的静脉血室温放置，使凝血，离心（6 000 r/min）10 min，以滴管小心吸取上部血清，每3只同样试验条件的血清合并，作为一个供试品，每试验组得3个供试品，按血清量的0.5倍滴加10%高氯酸溶液，振摇，混匀，超声处理5 min，离心（6 000 r/min）10 min，倾出上清液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
取金银花提取液0.1 ml，加水稀释至约0.5 ml，滴加0.5倍的10%高氯酸溶液，混匀，超声处理5 min，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，作为对照药材溶液。
2.4 色谱条件及系统适应性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈－0.3%磷酸为流动相，按表1进行梯度洗脱；检测波长为238 nm。理论板数按绿原酸峰计算应不低于2 000。表1 金银花流动相梯度表（略）
2.5 测定
分别吸取上述对照药材溶液、供试品溶液各20 μl，注入液相色谱仪，依法测定。图谱见图1～3。以绿原酸峰为参照峰，计算各色谱峰相对保留时间。结果见表2。
3 结果
含药血清供试品图谱与金银花药材对照图谱比较，部分含量高的药物成分吸收入血率较低。
为描述方便，对金银花药材hplc 图谱所分离得到的色谱峰按保留时间的先后进行了编号，以绿原酸峰为参照峰，计算了相对保留时间。图谱比较结果表明，绿原酸经口服后吸收迅速，代谢较快，血药浓度2h后就下降到不足30 min的20%，与文献报道一致［1］；6号峰、7号峰成分吸收入血后，代谢较慢，血药浓度维持时间要长一些；9号峰成分吸收入血较慢，代谢也较慢，2 h后血药浓度不下降，反而有所上升；多次给药的图谱中9,10号峰峰面积较一次性给药大很多，在血液中有蓄积现象。药材图谱中s峰（绿原酸峰），5，9，10，17，18，19号等含量较高的峰，吸收入血的比例相对很低，而6，7号峰的吸收入血的比例相对高得多，是否为金银花主要药效相关成分，值得进一步深入研究。表2 金银花小鼠血清hplc图谱相关峰分析（略）
因保留时间10 min以前的色谱峰数量少、峰面积小，且与溶剂峰混在一起，稳定性、重现性均较差，故本文只研究了保留时间10 min以后的色谱峰（包括金银花药材与空白血清）； # 带xue编号的峰为空白血清中检出的色谱峰。“+”表示此峰检出；“-” 表示此峰未检出；“±”表示此峰未检出峰面积，但有峰形；“+”表示此峰相对于上组相对应峰峰面积快速下降；“+?”表示此峰相对于上组相对应峰峰面积缓慢下降；“+?”表示此峰相对于上组相对应峰面积缓慢下降
4 讨论
血清药物化学主要是研究血清中的化学物质、观测血清中外源性活性物质及其作用和代谢规律的一门学科［2］。通过分析口服给药后血清中的活性成分，确定中药及复方的体内直接作用物质，将成为快速、准确的确定中药药效物质基础的有效途径，血清药物化学正是基于此而建立发展起来的［3，4］。
本文所选色谱条件是经指纹图谱研究确定的药效成分出峰多、分离度好的优化色谱条件。在血清药物化学研究中，血清的处理是关键，经比较研究甲醇沉淀法、乙腈沉淀法、高氯酸沉淀法得到的供试品，以10%高氯酸溶液沉淀法最佳，得到的供试品药物成分含量高，图谱清晰，金银花药效成分损失少。
本文首次应用血清药化方法对金银花的血清代谢成分进行了研究，建立了金银花血清药物成分液相色谱指纹图谱，方法稳定可靠，重现性好，能够全面反映金银花经胃给药吸收入血药物成分的变化，为确定金银花药效的物质基础与代谢作用机制奠定基础。笔者将进一步进行小鼠病理模型的血清药化图谱研究，与正常小鼠血清药物成分进行对比研究，建立谱效关系模型。
【参考文献】
［1］王素军,张志伟,赵艳红,等.建立大鼠原位肠-肝灌流模型评价绿原酸的代谢［j］.中国临床药理学与治疗学,2006，11:1340.
［2］李萍,刘惠如,黄涛.中药血清药物化学对中药现代化的意义［j］.中国药业,2007,16(2):58.
［3］王喜军.中药及中药复方的血清药药物化学研究［j］.世界科学技术-中药现代化,2002,4(2):1.
［4］冯瑜娟,邓 ?,孟宪丽.血清药物化学应用于中药复方配伍研究的思路探索［j］.中药药理与临床,2007,23(5):261.