响应面分析法优选生精汤中淫羊藿苷的提取工艺研究

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【摘要】 目的优选生精汤中淫羊藿苷提取的工艺条件。方法采用响应面分析法，以提取物淫羊藿苷含量为指标进行实验，考察料液比、乙醇浓度、提取时间等因素对提取工艺的影响。结果优选出醇提淫羊藿苷的最佳工艺为：加30倍量70％乙醇，回流提取1.75 h，提取两次。生精汤中淫羊藿苷的含量为1.36 μg/g。结论该方法简便易行，稳定性好，适于工业化生产中应用。

【关键词】 响应面分析法； 淫羊藿苷； 提取工艺； box-benhnken中心组合实验

生精汤由菟丝子、淫羊藿、熟地、补骨脂、女贞子等11味中药组成。经动物实验［1］证明生精汤能显著降低模型大鼠血清雄激素含量，增加血清雌、孕激素含量促排卵。经多年临床应用［2］证实的生精汤为中医药补肾活血法治疗女性多囊卵巢综合征的有效组方。淫羊藿为处方中的君药，淫羊藿苷类黄酮化合物为其主要有效成分，此外含有生物碱、木脂素、多糖和微量元素等。现代药理实验研究表明［3，4］，淫羊藿总黄酮具有性激素样作用，可以使雌性小鼠子宫增重、e2含量升高、雄性小鼠血清t含量升高。淫羊藿苷能延缓卵巢卵母细胞巢破裂，抑制原始卵泡的发育启动，减少卵泡的消耗，使处于静止期的原始卵泡数增多［5］。淫羊藿总黄酮为生精汤治疗女性多囊卵巢综合征的主要有效成分之一。响应面分析法［6］以回归方法作为函数估算的工具，将多因子试验中因子与试验结果的相互关系函数化，可研究因子与响应值之间、因子与因子之间的相互关系，并可进行优化。本文采用响应面分析法，以提取物淫羊藿苷含量为指标进行实验，考察药材的料液比、乙醇浓度、提取时间等因素对提取工艺的影响，优选淫羊藿苷的最佳提取工艺，以便提出更多的有效成分，提高治疗效果。

1 仪器与试药

1.1 仪器lc-10ad高效液相色谱仪（日本岛津公司），class-vp色谱工作站，gl-cq-250s超声波清洗机（上海杰理科技有限公司），ae-240电子天平(上海梅特勒一托利多仪器有限公司)。w一201b数显恒温水浴锅(上海申腾生物技术有限公司)，r-201旋转蒸发器 (上海申胜生物技术有限公司)。

1.2 材料与试剂生精汤中各药材（菟丝子、淫羊藿、熟地、补骨脂、女贞子、山药、鸡血藤、刘寄奴、王不留行、制香附、生麦芽）购自浙江中医药大学饮片厂，并经浙江中医药大学姚振生教授鉴定。

淫羊藿苷对照品购自中国药品生物制品检定所，批号：110737-200312，乙腈、甲醇(供高效液相色谱测定用)为色谱纯，超纯水，其余为分析纯。

2 方法与结果

2.1 淫羊藿苷的含量测定［7］

2.1.1 色谱条件

色谱柱为phenomenex-genmini-c18(4.6 mm×150 mm)；流动相为甲醇－水（52－48）；流速1.0 ml·min-1；检测波长270 nm；柱温30℃；检测灵敏度0.02aufs；进样量20 μl。

2.1.2 对照品溶液的制备

精密称取淫羊藿苷对照品2 mg，置10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每毫升含有0.24 mg淫羊藿苷的溶液，作为对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备

按处方取生精汤各味药材，精密称定，回流提取两次，合并提取液，混匀，浓缩至100 ml，取1 ml用0.45 μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。

2.1.4 标准曲线的制备

精密吸取对照品溶液，倍半稀释后，分别注入液相色谱仪，记录淫羊藿苷峰的峰面积。以进样浓度c(μg/g)为横坐标，峰面积a为纵坐标进行线性回归，回归方程为：a=2×106c+109 929，r=0.999 9。表明淫羊藿苷在4.8～0.15 μg范围内，线性关系良好。

2.1.5 精密度实验

精密吸取浓度为0.2 μg/μl的对照品溶液，重复进样5次，每次20 μl，测定峰面积，计算rsd=0.28%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 加样回收实验取已知含量的生精胶囊样品0.25 g，共5份，分别加入0.2 μg/μl的淫羊藿苷对照品10 μl，其余同“2.1.3”供试品溶液的制备方法制备，按“2.1.1”色谱条件进样20 μl，测定峰面积，并计算回收率，结果平均回收率为100.4%，rsd=2.5%，表明本方法具有较好的加样回收率。

2.2 淫羊藿苷提取工艺研究

2.2.1 响应面分析法

因素的选取及方案分析按照处方分别称取生精汤各药材，共20.4 g，根据box-benhnken中心组合实验设计原理［6］，综合单因素试验的结果，选取料液比、提取时间、乙醇浓度3个因素，每个自变量的低、中、高水平分别以-1，0，1编码，以淫羊藿苷得率作为响应值（y）。采用sas9.1.3对实验结果进行回归分析。试验因素与水平见表1，实验方案及结果见表2。

表2 实验因素与水平（略）表2 响应面实验安排及结果（略）

2.2.2 实验结果分析采用sas9.1.3软件对表2中不同试验条件下所得到的淫羊藿苷得率进行响应面回归分析，得拟合方程：y1=0.808 7 + 0.291 65 x1 + 0.044 25 x2+ 0.059 575 x3+ 0.021 2 x12- 0.172 6 x1x2 + 0.0377 x1x3- 0.093 6 x22 - 0.003 25 x2x3- 0.348 2 x32。　表3 回归方程显著性及方差分析（略）

由表3可知，在置信区间95%时，方程线性相关系数r= 0.989 1。证明回归方程真实、可靠，具有统计学意义，可用于替代实验点对实验结果进行分析。方程各自变量(xn)方差分析表明，方程一次项、二次项和交互项对多糖提取得率具有显著性影响，因此各因素与响应值之间不是简单的一次关系。并进一步对回归方程各项作显著性检验。表4 回归方程各项的显著性检验分析（略）

由表4可知，液料比对淫羊藿苷提取得率具有显著性影响，而提取时间、醇浓度则无显著性影响。根据回归分析结果作出相应曲面图和等值线图，见图1～3。利用sas软件，进行分析计算，得淫羊藿苷的最佳提取工艺条件为：液料比29.7∶1，提取时间1.78 h，乙醇浓度71.8%，在此条件下淫羊藿苷的理论提取得率为1.14 μg/g。结合实际操作方便和方差分析结果，确定最佳提取工艺条件为：加药材30倍量的70%的乙醇提取1.75 h，共提取两次。

2.2.3 验证性实验按照最佳提取工艺进行实验验证，提取3次，测得淫羊藿苷的平均得率为1.36 μg/g，rsd为3.51%。结果见表5。表明该工艺稳定可行，重复性好。表5 验证性试验结果（略）

3 讨论

本研究采用响应面分析法对淫羊藿苷提取工艺进行优化，并得到回归方程。其最佳提取工艺条件为：加药材30倍量的70%乙醇提取两次，每次1.75h，结果淫羊藿苷得率为1.36 μg/g。

传统的数理统计往往采用正交设计或均匀设计［8］，寻求最佳的因素水平组合，但不能在给出的整个区域上找到因素和响应值之间的一个明确的函数表达式，从而无法找到整个区域上的因素的最佳组合和响应的最优值。响应面分析法是通过中心组合实验研究几种实验因素间相互作用的一种回归分析方法，具有周期短，实验次数少，回归方程精确度高等优点，并能从图形方面分析寻求最优实验考察因素。本实验利用响应面分析法所得淫羊藿苷提取最佳工艺，具有操作方便、重复性好、提取效率高等优点，稳定可行。

【参考文献】

［1］周 璐，章巧萍，徐孝平，等．生精汤对雄激素致无排卵模型大鼠卵巢功能及形态学的影响［j］．浙江中医药大学学报，2006，30（6）：621．

［2］章巧萍．浅谈补肾活血法治疗多囊卵巢综合征［j］．中医药信息杂志，2004，11(11)：1014．

［3］黄 菊，罗丽莉，傅玉才，等．淫羊藿甙对大鼠早期卵巢卵泡发育和卵母细胞凋亡影响的初步研究［j］．中国现代医学杂志，2007，17（5）：523．

［4］刘 娟，朱兆荣，汪江华，等．淫羊藿、补骨脂及其复方提取液的性激素样作用观察［j］．中国兽医杂志，2003，39(6) ：33．

［5］叶海涌，刘 健，楼宜嘉．淫羊藿苷衍生物的制备及其雌激素样作用研究［j］．浙江大学学报(医学版)，2005，34(2)：131．

［6］carlson r·designs forexplorative experiments in organic synthetic chemistry［j］．chemometrics and lntelligent labo-ratory systems，2004，73(1)：63-72，151．

［7］国家药典委员会．中国药典，ⅰ部［s］．北京：化学工业出版社，2005：205．

［8］孙振球．医学统计学［m］.北京：人民卫生出版社，2002：181．