毛蕊花糖苷抑制脂多糖诱导的BV―2小胶质细胞炎症反应及机制研究

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[摘要] 探究毛蕊花糖苷（acteoside，ACT）对细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的BV-2小胶质细胞神经炎症反应的抑制作用及潜在机制。该实验以LPS诱导BV-2细胞作为炎症模型，将BV-2细胞分为正常对照组、模型组、给药组，ACT按指定浓度（12.5，25，50 μmol・L-1）作用于细胞。采用NO试剂盒检测NO炎症因子的释放量，ELISA法检测TNF-α和IL-6的表达量，Western blot法检测炎症相关蛋白（iNOS，COX-2，p-IKKβ，IKKβ，p-IκB，IκB）的表达。此外，通过检测细胞核/浆中NF-κB p65的表达以及借助免疫荧光技术，阐明ACT对炎症转录因子NF-κB p65核转位的作用。结果显示，ACT可显著降低LPS诱导的BV-2小胶质细胞神经炎症，且呈剂量依赖性。具体表现在：显著降低炎症因子NO，IL-6和TNF-α的释放量，抑制炎症相关蛋白iNOS和COX-2的表达。同时，ACT可明显抑制NF-κB信号通路中关键蛋白IKKβ和IκB的磷酸化，且明显抑制NF-κB p65的细胞核转位。以上结果表明，毛蕊花糖苷可显著降低LPS诱导的小胶质细胞神经炎症反应，抑制炎症相关蛋白的表达，其潜在机制是通过抑制NF-κB信号通路实现的。

[关键词] 神经炎症；小胶质细胞；细菌脂多糖；毛蕊花糖苷；NF-κB通路

[Abstract] To investigate the inhibitory effects of acteoside （ACT） on BV-2 microglial cells and the potential mechanism，LPS was used to treat BV-2 cells with or without ACT （12.5，25，50 μmol・L-1）. Then， the expressions of inflammatory factors （NO，TNF-α，IL-6） and inflammation related proteins （iNOS，COX-2，p-IKKβ，IKKβ，p-ⅠκB，ⅠκB） were detected. In addition，the nuclear translocation of NF-κB was explored. The results showed that ACT could significantly suppress the inflammatory response against LPS stimulation by decreasing the expressions of NO，IL-6，TNF-α，iNOS，COX-2 and the phosphorylations of IKKβ and IκB. Moreover，the nuclear translocation of NF-κB p65 was inhibited by ACT. Taken together， ACT could significantly inhibit the inflammatory response of BV-2 microglial cells which were induced by LPS via inhibition of NF-κB signaling pathway.

[Key words] neuroinflammation；microglial cells；lipopolysaccharide；acteoside；NF-κB signal pathway

doi：10.4268/cjcmm20161322

阿尔兹海默症（Alzheimer′s disease，AD）是一种常见的多病因中枢神经系统退行性疾病，为老年人痴呆症的主要类型之一。已有研究表明，AD患者脑内存在大量炎症特性，如炎症细胞因子及趋化因子增加，损伤部位小胶质细胞过度激活而聚集等[1]。目前发现，可以过度激活小胶质细胞的因素非常多，如LPS[2]，炎症因子（TNF-α，IL-6等），淀粉样蛋白（Aβ）等，这些炎症信号可通过各种传导通路作用于脑部，进而激活小胶质细胞[3]。

毛蕊花糖苷（acteoside，ACT）是列当科肉苁蓉的主要活性成分之一，现代药理学研究发现，在以冈田酸诱导的阿尔茨海默病（AD）细胞模型中，ACT能够通过抑制tau蛋白过度磷酸化来发挥神经保护作用[4]。还可能通过抑制小鼠脑皮层组织中caspase-3基因表达，维持皮层组织神经细胞的正常形态及数量，实现对小鼠脑损伤的保护作用[5]。本实验从抗炎角度，以LPS诱导bv-2小胶质细胞炎症模型为研究对象，旨在探究毛蕊花糖苷的抗炎作用及潜在机制，为其防治神经系统退行性疾病提供理论与实验依据。

1 材料

1.1 细胞 BV-2小胶质细胞系购自中国医学科学院细胞中心。

1.2 药物 毛蕊花糖苷购自宝鸡市辰光生物科技有限公司。

1.3 试剂与仪器 DMEM培养基（Macgene）；胎牛血清（PAN Biotech）；NO化学法试剂盒（南京建成）；溴化噻唑蓝四氮唑（MTT），荧光染料4’， 6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）（Sigma）；ELISA试剂盒（Excell Biotech）；细胞核/浆蛋白提取检测试剂盒（南京建成生物公司）；蛋白抗体（Cell Signaling Technology）；Tanon-5200Multi凝胶成像分体系统（天能）；Sunrise-Basic酶标仪（TECAN）；TCS SP5-Confocal-MP-FCS（Leica）。

2 方法

2.1 细胞培养与处理 BV-2小胶质细胞系用高糖DMEM培养基（含10%胎牛血清，100 U・L-1青霉素，100 μg・L-1链霉素）进行传代培养，每天传代1次。

将细胞分为空白组，模型组和不同浓度药物处理组（12.5，25，50 μmol・L-1）组。LPS诱导炎症模型的质量浓度为1 mg・L-1。

2.2 MTT法检测细胞存活率 BV-2细胞系以5×104密度接种于48孔板，培养过夜，模型组用LPS诱导炎症，药物处理组按照上述3种浓度，同时处理细胞，24 h后弃上清，加MTT （0.5 g・L-1）染色，温箱孵育2 h；弃上清，加入DMSO，酶标仪检测吸光度（A570 nm）。

2.3 细胞上清液NO含量测定 BV-2小胶质细胞系接种于48孔板，密度为5×104个/孔，模型组LPS诱导炎症，药物处理组按上述3种浓度给药，NF-κB通路抑制剂组（Bay 11-7082，5 μmol・L-1）同时处理。24 h后用NO化学法试剂盒检测NO浓度，按照说明书操作，最后用酶标仪检测吸光度（A570 nm）。

2.4 ELISA检测炎症因子IL-6和TNF-α的表达 将细胞接种于48孔板，密度为5×104个/孔，12 h后，按照上述分组处理细胞，到达指定时间后，收集上清200 μL/孔。按照说明书操作，最后用多功能酶标仪检测吸光度（A450nm）。

2.5 Western blot蛋白免疫印记分析 按上述分组处理细胞，分别作用24 h（测iNOS，COX-2）、1 h（测IκB，p-IκB，NF-κB）、10 min（测IKK，p-IKK）后，收集各组细胞并用RIPA裂解液（内含蛋白酶抑制剂）裂解细胞，获得总蛋白。然后采用6%～15% SDS-PAGE分离蛋白，半干法将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭20 min，加入一抗（1∶1 000），室温孵育2 h，充分洗涤，加入二抗（1∶1 000），室温孵育1 h，充分洗涤后，加ECL试剂显色，在凝胶成像系统上拍照。用Gel-Pro软件进行条带的吸光度积分分析。

2.6 免疫荧光检测核转录因子-κB （NF-κB p65）核转位情况 将显微镜盖玻片铺到24孔板中，以3×104个/孔接种细胞，培养过夜，分为对照组、模型组和50 μmol・L-1药物处理组，温箱孵育1 h后，4%多聚甲醛固定20 min，0.5% Triton X-100处理细胞30 min，加入封闭液（5% BSA in PBST），室温封闭30 min。然后加一抗（1∶200），4 ℃过夜，PBS冲洗3遍，加荧光二抗（1∶200）孵育1 h，PBS冲洗3遍，再用DAPI（50 mg・L-1）避光处理20 min，PBS洗3遍，甘油封片，最后用共聚焦显微镜拍照。

2.7 统计学分析 所有数据用±s表示。采用GraphPad Prism 5统计学软件进行t检验和单因素方差分析，P

3 结果

3.1 ACT对细胞存活率没有影响 结果显示，ACT在12.5，25，50 μmol・L-1 3个浓度剂量下，对小胶质细胞的存活率无显著性影响，表明在此实验条件下，ACT对细胞无明显毒性（图1）。

3.2 ACT显著抑制LPS诱导的BV-2细胞中NO，TNF-α和IL-6的释放 模型组NO释放量显著高于正常组（P

3.3 ACT显著抑制LPS诱导的BV-2细胞中iNOS和COX-2蛋白的表达 诱导性NO合酶（iNOS）和环氧合酶-2（COX-2）是核转录因子NF-κB p65调控的2个重要炎症相关蛋白。当炎症发生时，小胶质细胞显著活化，iNOS和COX-2会相应的催化产生大量NO等炎症因子，进而造成神经炎性损伤，诱导细胞凋亡[6]。实验中，采用Western blot方法检测此2种蛋白的表达，相比于LPS模型组，ACT可明显降低iNOS和COX-2的表达，且呈剂量依赖性（图3）。

3.4 ACT显著抑制NF-κB炎症信号通路中关键蛋白的激活 通过Western blot法检测NF-κB通路中关键蛋白的表达，当LPS刺激细胞后，IKKβ表达量不变，IκB的表达量显著降低，而二者的磷酸化产物表达量均显著升高。加入ACT进行干预后，IKKβ和IκB的磷酸化产物成剂量依赖性降低，另外IκB的表达量显著升高，且具有统计学意义，表明ACT可明显抑制NF-κB通路的激活（图4）。

3.5 ACT抑制LPS诱导的BV-2细胞中NF-κB的核转位 NF-κB是参与炎症反应的一个重要转录因子。在静息态细胞中，NF-κB与抑制因子IκB形成复合体，以无活性形式存在于胞浆中，受到外界信号（如LPS）刺激后，经过一系列反应，NF-κB从胞浆转移到胞核，促进相应基因转录表达，调节炎症因子的生成[7]。从本实验结果（图5）可以看出，LPS模型组中，胞浆内NF-κB p65含量明显低于空白组，加ACT（50 μmol・L-1）干预后，其在胞浆中含量明显升高。说明ACT可一定程度上抑制LPS刺激的NF-κB p65核转位现象。另外，通过Western blot法分别检测了胞核与胞浆中NF-κB p65蛋白的表达。在空白组中，NF-κB p65主要存在于细胞浆；模型组NF-κB p65入核明显，胞浆中的含量明显下降；ACT干预后，NF-κB p65分布再次以胞浆为主（图6）。由此再次证明，ACT可抑制LPS诱导的NF-κB p65核转移。此外，加入NF-κB抑制剂Bay 11-7082后，BV-2细胞中的NO释放量明显降低（图6），这也进一步证实了NF-κB信号通路在调节神经炎症过程中的重要性。总之，这些结果为进一步阐明ACT的抗炎机制提供了有益的参考。

4 讨论

神经炎症是除Aβ沉积和tau蛋白磷酸化外，导致多种急慢性神经退行性疾病的重要因素[8]。小胶质细胞被公认为定居在脑内的巨噬细胞，在调节AD的慢性炎症中发挥主要作用，一方面，小胶质细胞的激活可以清除脑内细胞碎屑、凋亡的神经元细胞以及潜在的有害物质，维持正常的中枢神经系统环境；但另一方面，当小胶质细胞被特定因素（如LPS）过度激活时，其分泌多种炎症因子并能导致神经退行性疾病的发生，这些炎症因子又会反过来促进小胶质细胞的聚团、活化，从而形成恶性循环[9]。因而，寻找能够降低脑内炎症反应的药物具有非常重要的意义。

从列当科植物肉苁蓉的肉质鳞茎中提取得到的毛蕊花糖苷，是一类具有广泛生物活性的苯乙醇苷类成分。本实验发现，毛蕊花糖苷能够显著抑制LPS所诱导的神经炎症，抑制炎症相关因子NO，IL-6和TNF-α的释放，下调炎症相关蛋白iNOS和COX-2的表达，但ACT对炎症因子PGE2的抑制作用相对较弱，推测PGE2可能不是ACT抑制神经炎症反应的主要效应因子。进一步研究发现，ACT主要通过抑制NF-κB信号通路发挥作用，即抑制上游蛋白IKKβ和IκB的磷酸化，减少NF-κB p65蛋白的激活及核转移，进而减少NF-κB p65与靶基因结合后释放各种炎症因子，从而发挥显著的抗神经炎症作用。

综上所述，本实验从抗神经炎症角度探讨毛蕊花糖苷的神经保护作用，并阐明了该化合物的抗炎作用机制，这对今后开发具有抗神经炎症作用的药物及神经炎症相关疾病的治疗具有重要的参考意义。

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[5] 彭晓明，高莉，霍仕霞，等. 类叶升麻苷对阿尔采末病小鼠皮层 caspase-3基因表达的影响[J]. 中国药理学通报，2014，30（12）：1763.

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[7] 陈丹英，翟中和，舒红兵，等. NF-κB激活的调节机理[J]. 科学通报，2003，48（18）：1893.

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