开心散对单胺氧化酶活性的影响
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[摘要]该研究观察抗抑郁中药古方开心散（KXS）在体内外对单胺氧化酶（MAO）活性的影响，从代谢的角度探索KXS升高单胺类神经递质水平的机制。通过在体外酶反应体系和神经胶质细胞C6中分别观察不同浓度的KXS对MAOA和MAOB活性的影响；在动物水平的研究中，分别观察不同浓度的KXS灌胃给药1周、2周和3周后，对正常大鼠和孤养结合慢性不可预见性中等强度应激（CMS）模型大鼠脑线粒体MAOA和MAOB的活性的影响。结果显示，10 g・L-1的KXS在酶反应体系中能显著降低MAOA和MAOB的活性；在C6细胞中，0625～10 g・L-1的KXS对MAOA的活性没有显著影响，但对MAOB的活性有较明显的抑制作用，且呈浓度依赖关系；KXS作用1，2，3周对正常大鼠脑内MAOA和MAOB均没有显著地影响；338 mg・kg-1剂量给药2周和3周后，CMS大鼠脑内MAOA活性较模型组均有所降低（P
[关键词]开心散；单胺氧化酶；代谢；慢性应激
[Abstract]To observe the effect of antidepressant medicine prescription， Kaixinsan （KXS） on monoamine oxidase （MAO） activity， and explore the mechanism of KXS in elevating the levels of monoamine neurotransmitter from the perspective of metabolism， in vitro enzyme reaction system and C6 neuroglial cells， the effect of KXS at different concentrations on MAOA and MAOB activity was observed In animal studies， the effect of KXS at different concentrations on MAOA and MAOB activities of brain mitochondrialin normal rats and solitary chronic unpredictable moderate stress （CMS） model rats after intragastric administration for 1， 2， 3 weeks Results showed that 10 g・L-1 KXS could significantly reduce the activity of MAOA and MAOB in enzyme reaction system； and in C6 cells， KXS within 062510 g・L-1 concentration range had no significant effect on the activity of MAOA， but had obvious inhibitory effect on the activity of MAOB in a dose dependent manner KXS had no significant effect on the activity of MAOA and MAOB in brains of normal rats after action for 1， 2， 3 weeks After 2 and 3 weeks treatment with 338 mg・kg-1 dose KXS， MAOA activity in the brain of CMS rats was decreased as compared with the model group （P
[Key words]Kaixinsan； monoamine oxidase； metabolism； chronic stress
doi：10.4268/cjcmm20161023
开心散（Kaixinsan，KXS）是治疗中医情志病的经典方，由人参、远志、茯苓和石菖蒲4味药组成。前期研究表明，开心散治疗抑郁症与国际公认的抗抑郁药氟西汀疗效相当，但较氟西汀起效时间早，临床控制率高、副作用小，是治疗抑郁症安全有效的中药制剂，值得进一步深入研究。开心散能够显著升高强迫游泳小鼠和慢性应激大鼠神经中枢的5羟色胺（5HT）的含量，显示明显的抗抑郁作用。5HT是一种重要神经递质，5HT系统功能低下被认为是抑郁症发病的重要机制之一，也是目前抗抑郁治疗的重要靶点。5HT的合成、释放、转运、再摄取等任一环节异常都会导致精神情绪方面的疾病。
单胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）主要存在于细胞内线粒体外膜上，是机体内参与胺类物质代谢的主要酶类，其代谢底物主要为外源性和内源性的单胺类物质。由于单胺类物质在机体内多具有重要的生理功能，因此，MAO的作用就表现得十分重要。根据其作用底物，分布位置和选择性抑制剂的不同，可将MAO分为2类，即MAOA和MAOB。单胺氧化酶抑制剂是临床上用于治疗多种疾病的一类药物，其中单胺氧化酶A抑制剂主要用于治疗抑郁症，而单胺氧化酶B抑制剂主要用于治疗帕金森病。本研究主要在体外和体内研究开心散对MAOA和MAOB活性的影响。
1材料
健康雄性Wistar大鼠，入组时体重160～180 g，北京维通利华实验动物中心提供，许可证号SCXK（京） 20120001。
大鼠神经胶质瘤细胞株C6由本科室保存，细胞置于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37 ℃，5% CO2，饱和湿度条件下培养。
人参、远志、茯苓、石菖蒲均由中国人民总医院中药房提供。称取人参222 g，茯苓222 g，石菖蒲148 g，远志148 g，人参用60%乙醇回流，加热回流提取4次，每次1 h，合并提取液并过滤备用，人参药渣备用；石菖蒲加水6倍浸泡12 h，提取挥发油8 h，所得挥发油加入乙醇制成50%油醇溶液备用；石菖蒲药渣、人参药渣与茯苓、远志等2味药加水74 L，提取3次，每次1 h，合并药液，浓缩，加50%乙醇，冷藏过夜，滤过。滤液与人参提取液合并，回收乙醇，浓缩，减压干燥。给药前按人参茯苓远志石菖蒲3∶3∶2∶2加入石菖蒲挥发油。1 g干粉相当于483 g生药，提取的得率为207%。
司来吉兰和氯吉兰均购自美国Sigma公司。MAOGlo试剂盒（Promega公司，批号12091225）；组织线粒体提取试剂盒（普利莱公司，批号20140301）；BCA蛋白定量试剂盒（普利莱公司，批号130140211）；DMEM培养基（普利莱公司，批号130140211），胰蛋白酶（Gibco公司，批号25200056）；PBS（北京中山生物技术有限公司，批号086110）。
2方法
21KXS对酶反应体系中MAOA和MAOB活性的影响取正常SD大鼠（北京维通利华实验动物中心）脑组织制备单胺氧化酶。将大鼠麻醉，取脑，称重，脑组织用预冷的生理盐水漂洗后置于玻璃匀浆器中，加入线粒体提取试剂MitoCyto Buffer（001 L・g-1），冰上匀浆。将匀浆液转移到EP管中，4 ℃，800×g离心5 min，重复2次。取上清于4 ℃，12 000×g离心10 min，弃上清，得到的线粒体沉淀用02 mL MitoCyto Buffer重悬，得到线粒体悬液采用BCA法定量，分装备用。在白色不透光的96孔板中，各孔分别加入125 μL MAOA底物或MAOB底物，125 μL不同浓度的阳性药或不同浓度的开心散（031，0625，125，25，5，10 g・L-1），正常对照组加入125 μL相应的反应Buffer；然后加入25 μL MAO酶液（1 μg），快速混匀；室温孵育1 h，加入50 μL重组的萤光素酶检测试剂，室温孵育20 min，多功能酶标仪检测各孔的化学发光强度（RLU）。抑制率（IR）=[（对照组RLU-干预组RLU）/对照组RLU] ×100%。
22KXS对C6细胞内MAOA和MAOB活性的影响取对数生长期的C6细胞，制备浓度为1×105个/mL单细胞悬液，接种至96孔板中（每孔100 μL），在37 ℃，5% CO2饱和湿度条件下培养24 h，然后分别加入质量浓度为10，5，25，125，0625 g・L-1的开心散药液，每个浓度3个复孔，每孔10 μL，阳性药孔加入司来吉兰（05 μmol・L-1）或氯吉兰（005 μmol・L-1），正常组加入等体积的空白培养基，继续培养24 h。弃上清，收集细胞，加入细胞裂解液，裂解30 min，3 000 r・min-1离心5 min，得到细胞上清，按照MAOGlo试剂盒说明书检测各组上清液中MAOA和MAOB的活性。
23开心散对正常大鼠脑内单胺氧化酶活性的影响实验设置1，2，3周3个时间点，每个时间点除给药时间不同，其余实验方法均相同。具体方法如下：大鼠随机分为5组，每组10只，每笼5只，正常饲养。动物适应3 d后开始灌胃给药，阳性对照药为氯吉兰和司来吉兰，给药剂量分别为氯吉兰186 mg・kg-1・d-1（相当于成人临床用量20 mg・kg-1・d-1），司来吉兰093 mg・kg-1・d-1（相当于成人临床用量10 mg・kg-1・d-1），开心散的给药剂量为676，338 mg・kg-1・d-1。给药结束后，将大鼠麻醉，取脑，制备线粒体，蛋白定量后将各组动物脑线粒体浓度调节一致，然后按照试剂盒说明书检测各组脑线粒体悬液中MAOA和MAOB的活性。
24开心散对慢性应激模型大鼠脑内单胺氧化酶活性的影响实验设置3个时间点，每个时间点除给药时间不同，其余实验方法均相同。具体方法如下：所有大鼠适应环境1周后采用Openfiled评分，选取评分接近的大鼠随机分组，每组10只。除空白组每笼5只，不给任何刺激外，其余各组均每笼1只饲养，连续给予不可预知的刺激21 d，包括停食（24 h）、停水（24 h）、冰水游泳（15 min）、昼夜颠倒、束缚（2 h）、振荡（15 min）、夹尾（3 min），每天随机安排1周，平均每种刺激使用3次。第22天开始上午刺激，下午给药。所有动物采用灌胃给药，给药剂量和检测方法同23项。
25统计分析结果用±s表示。用Sigmaplot 100绘图软件做图，采用SPSS 160统计软件进行数据处理，组间均数比较均采用单因素方差分析（OneWay ANOVA），P
3结果
31KXS对酶反应体系中MAOA和MAOB活性的影响开心散及阳性药在体外酶反应体系中对单胺氧化酶活性的抑制作用见图1，不同浓度的氯吉兰、司来吉兰可分别显著抑制大鼠脑内MAOA和MAOB的活性，IC50分别为0036，023 μmol・L-1，而开心散对MAOA和MAOB活性的IC50分别为791，786 g・L-1，只有10 g・L-1的开心散对MAOA和MAOB的活性有显著的抑制作用（P
32KXS对C6细胞内MAOA和MAOB活性的影响开心散对C6细胞内单胺氧化酶活性的抑制作用见图2。10，5，25，125，0625 g・L-1的开心散作用C6细胞24 h后对C6细胞内MAOA的活性没有明显的影响，但对MAOB的活性则表现出一定的抑制作用，且呈现浓度依赖关系。
33开心散对正常大鼠脑内单胺氧化酶活性的影响开心散连续灌胃给药1，2，3周后，化学发光法检测各组大鼠脑内MAOA和MAOB的活性，结果见图3，与阴性对照组相比，给药1，2，3周后开心散对正常大鼠脑内的MAOA和MAOB活性均没有显著的影响。
34开心散对慢性应激模型脑内单胺氧化酶活性的影响在孤养结合连续给予慢性的不可预知的刺激后，CMS大鼠模型脑内MAOA活性与正常组相比显著升高，且随着刺激时间的延长，升高的越显著；而MAOB活性与正常组相比无明显变化。338 mg・kg-1剂量给药2，3周后，CMS大鼠脑内MAOA活性较模型组均有所降低（P
4讨论
目前，针对抑郁发病机制和抗抑郁治疗药物研究的热点聚焦在神经递质系统（包括5羟色胺5HT、去甲肾上腺素NE）与下丘脑垂体肾上腺轴（HPA轴）和脑内高度表达的蛋白质及其信号传递通路[1]。由于抑郁症的发生是上述所有已知或未知多个因素作用的结果，针对每一个系统的研究都只能说明抑郁发生的部分机制，不能完全解释抑郁症的发生及抗抑郁治疗药物作用的机制。因此，人们寄希望于传统的中医药，能够发挥多环节、多靶点调节的优势和特点。
开心散是唐宋以来中医传统益气养心、安神定志的代表方和基本方，为多家重要方书所收载，它由远志、人参、茯苓和石菖蒲4味药组成。该方主治的悲忧不乐、神思不安、善忘、心悸怔忡等症与西医范畴的神经症（以抑郁、焦虑症状为主）非常相似。本课题组针对开心散在治疗中医情志病（主要以抗抑郁和增强学习记忆能力）的作用和机制方面进行了大量的研究工作。在多个经典的抗抑郁模型（小鼠强迫游泳和小鼠悬尾模型、大鼠强迫游泳模型、大鼠不可预知慢性应激模型及结合孤养模型）上，《太平惠民和剂局方》开心散都表现出了明显的抗抑郁作用[25]；同时，给药3 d后的小鼠悬尾和强迫游泳模型上以及CMS大鼠模型上，开心散表现出非常明显的升高抑郁小鼠和大鼠脑内5HT，DA，NE含量的作用[4，6]。
5HT 是一种重要神经递质，参与机体的多种生理活动，包括学习记忆、精神活动等的中枢调节。脑内5HT的减少直接与精神及情绪变化有关，5HT系统功能低下被认为是抑郁症发病的重要机制之一，也是目前抗抑郁治疗的重要靶点[7]。目前的抗抑郁药物主要针对5HT的合成、代谢、转运、再摄取中的代谢和重摄取开发。5HT在神经元突触间隙的清除，主要通过神经末梢特异的蛋白体，即5羟色胺转运体（serotonin transporter， 5HTT）来重摄取而失活清除[810]。
单胺氧化酶是一类黄素依赖性蛋白。多种神经精神疾病如抑郁症、AD等患者体内MAO活性异常。MAO有2种同工酶：MAOA和MAOB，二者有不同的作用底物和特异性的抑制剂。前者主要氧化去甲肾上腺素、5羟色胺，被氯吉兰选择性抑制。后者主要降解苄胺和苯乙基胺，被司来吉兰选择性抑制。
本实验在体外的分子细胞水平和体内的动物水平系统地研究了开心散对MAOA和MAOB活性的影响。研究发现，10 g・L-1的开心散在体外MAOA和MAOB的活性均有一定的抑制作用，且对2种酶活性的抑制没有选择性，与阳性药相比相差约1×106倍。但在神经胶质细胞C6中，开心散选择性地抑制MAOB的活性，且表现出了浓度依赖性，由于MAOB主要存在于神经胶质细胞，且是神经退行性疾病的主要靶点，由此推测开心散有提高学习记忆的功能。
应激是导致人类产生抑郁的重要原因，慢性应激大鼠抑郁模型是通过改变动物生活的周围环境而诱发其行为活动异常，产生抑郁，已被广泛应用于抗抑郁药的筛选和机制研究。本实验研究发现，与正常组相比，慢性应激模型大鼠脑内MAOA的活性随着造模时间的延长而升高，但MAOB活性没有明显的变化，表明MAOA活性的升高与抑郁的产生密切相关。338 mg・kg-1剂量的开心散给药2周和3周后，CMS大鼠脑内MAOA活性较模型组均有所降低（P
综上，开心散对单胺氧化酶A的抑制作用不是十分显著，其可能不是通过抑制MAOA的活性来升高5HT的含量的。因此，开心散对5HT合成和重摄取途径影响的研究将成为必要。
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