台湾过山香组培快繁技术研究

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摘要 以当年生台湾过山香带腋芽半木质化茎段作为外植体，开展组织培养试验研究，建立组培快繁体系。结果表明：最佳外植体诱导培养基为1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，诱导率可达89.7%；最佳增殖培养基为DCR+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.1 mg/L，增殖率达5.24倍，继代周期为35 d，不定芽生长状况好；最佳生根培养基为1/2MS+IBA 0.5 mg/L+ABT 1生根粉0.4 mg/L，生根率达95.26%；以泥炭土∶黄心土∶珍珠岩∶钙镁磷肥（3.0∶2.0∶1.0∶0.2），移栽成活率达93.7%，且7 d缓苗，茎秆木质化迅速，茎叶浓绿，长势好。

关键词 台湾过山香；药用植物；组织培养；快繁；基质

中图分类号 S666.9 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2014）15-0089-03

Study on Tissue Culture Techniques for Clausena excavata Burm. f.

CHEN Shao-huang

（Fujian Sanming Forestry School，Sanming Fujian 365001）

Abstract Stems with axillary buds from Clausena excavata Burm. f. were used as explants for tissue culture and tissue culture was establishment.The results showed that the suitable medium of explants inducing was 1/2MS supplemented with 6-BA 1.0 mg/L and NAA 0.1 mg/L，and the inducing rate was 89.7%.The DCR supplemented with 6-BA 0.8 mg/L and NAA 0.1 mg/L was the optimized proliferating medium with multiplication coefficient being 5.24 and the growth cycle being 35 d，and the shoots grew well. The best rooting medium was 1/2MS supplemented with IBA 0.5 mg/L and ABT 1 rooting power 0.4 mg/L，and the rooting rate was 95.26%.The plantlets were transplanted in mixture media with peat，yellow soil and perlite calcium magnesium phosphate（3.0∶2.0∶1.0∶0.2），and the survival rate was 93.7%.And 7 d later，the seedling was survival，stem was quickly lignification，leaf was deeper green and growing well.

Key words Clausena excavata Burm. f.；medicinal plant；tissue culture；rapid propagation；stroma

台湾过山香（Clausena excavata Burm.f.）属芸香科（Rut-aceae）黄皮属（Clausena Burm. f.）植物，又名山黄皮，小叶臭黄皮、臭黄皮、假黄皮等[1]，我国台湾省习用名称蕃仔香草、龟里椹。分布于我国台湾岛、福建、海南、广东、云南、广西以及柬埔寨、泰国、缅甸、老挝、印度、越南等地，生于湿热河谷、山地、杂木林或灌木丛中[2]。

过山香（Clausena excavata）由于茎叶具有一种特殊的香味，且甚浓郁而不易散失，故称之“过山香”[3]。其枝叶浓密，单数羽状复叶，披针形，丛集在枝端；过山香叶片歪形的小叶极不对称，从中脉处分成两半，上半部极大，下半部却极小，果长椭圆形，成熟时红色，味甜可食。是园林绿化不可多得的珍奇品种。是一种珍稀药用木本中药材，以根、叶入药。药性苦、辛、温。疏风解表，行气利湿，截疟，解毒。主治上呼吸道感染，流行性感冒，疟疾，急性胃肠炎，痢疾，风湿病；外用治湿疹、毒蛇咬伤[2]。过山香药材及其水和乙醇提取物对肝癌、结肠癌均有良好的抑制作用，为治疗癌症提供了新的用药选择[4]。

台湾省过山香药用价值较高，而目前引种栽培仍以种子繁殖为主，种源资源极其有限，导致苗木资源严重短缺。选择台湾省过山香优株无性系进行组培快繁，以期为台湾省过山香优质苗木的规模化快繁生产提供科学依据，为其珍稀中药材资源培育与开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2012年5月10日在福建三明林业学校生物技术研究所引种苗圃基地，选取当年生、健壮、无病虫害的台湾过山香植株。以其当年半木质化茎段为繁殖材料。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体采集及消毒。5月在连续晴天的天气的第3天选取有腋芽半木质化的茎段作为外植体[5]，剪去羽状复叶及茎尖，保留叶柄长1～2 cm，用饱和洗涤液浸泡处理20 min，将茎段表面用软毛刷清洗干净，然后再用流动的水冲洗30 min，再将其放在超近工作台中剪成带1～2个节间的茎段，放入0.1% KMnO4水溶液中浸泡5 min，无菌水冲洗5遍，75%乙醇处理8 s，再用0.1%升汞（HgCl2）水溶液浸泡处理10 min，无菌水冲洗5遍，取出用无菌滤纸吸干水分，用刀切去茎段离各伤口0.3 cm部分。接种于芽诱导培养基上。

1.2.2 培养基及培养条件。

（1）芽诱导培养基试验。试验设置6个处理，分别为①1/2MS、②1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L、③1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L、④1/2MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L、⑤1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L、⑥1/2MS+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，每个处理50瓶，每瓶接种1个茎段外植体。30 d后对无菌率（未污染外植体数/接种外植体数）、诱导率（诱导成芽外植体数/未污染外植体数）及不定芽生长状况进行观察统计。以上培养基中均添加全量MS中铁盐及有机物。

（2）增殖培养基。以DCR培养基为基本培养基，添加6-BA（0.5、0.8、1.1 mg/L）及NAA（0、0.1、0.2 mg/L）进行双因素组合试验，同时以空白DCR培养基作为对照，以上培养基均添加抗坏血酸3 mg/L。每个处理3次重复，每次重复20瓶，每瓶接种5个单芽，每个单芽带2～3个真叶，30 d后对增殖率[增殖率（PR）=丛生芽个数/转入单芽数]及生长状况进行观察统计。

（3）生根培养基。以1/2MS为基本培养基，添加IBA（0.3、0.5、0.7 mg/L）及ABT1生根粉（0、0.2、0.4 mg/L）进行双因素组合试验，以1/2MS空白培养基作对照，培养基均添加活性炭（AC）0.5 g/L。每个处理3次重复，每次重复20瓶，每瓶接种5个长2 cm左右的单芽，每个单芽带2～3个真叶，20 d后统计生根率，观察根系生长状况。

以上培养基中均添加蔗糖30 g/L（生根培养基添加20 g/L），卡拉胶6.7 g/L，pH值5.6～5.8，在121 ℃下灭菌20 min。培养条件为温度（25±1）℃，连续光照时间12 h/d，光照强度3 500 lx。

1.3 试验实施

待生根瓶苗90%长出根原基且60%发根长为1 cm时进行炼苗，7 d后将瓶苗开盖炼苗2 d，起苗洗净根部培养基，净苗浸泡70%百菌清1 000倍液进行移栽。移栽基质为：Ⅰ泥炭土∶珍珠岩∶钙镁磷肥（3.0∶1.0∶0.2），Ⅱ黄心土∶珍珠岩∶钙镁磷肥（3.0∶1.0∶0.2），Ⅲ泥炭土∶黄心土∶珍珠岩∶钙镁磷肥（3.0∶2.0∶1.0∶0.2）；每处理3次重复，每次重复500株，培养环境温度20～25 ℃，喷雾保湿，保持空气湿度85%～95%，覆盖遮荫率70%遮阳网，每7 d喷洒1次广谱杀菌剂（70%百菌清、代森锰锌1 000倍液交替使用），12 d后长出新根，喷浇单倍MS大量溶液，约10 d后长出新叶，揭开遮阳网全光照培养，此时统计成活率，观察苗木长势。

1.4 试验数据统计方法

试验数据采用Excel进行方差分析[6]，并用新复极差法进行多重比较[7]。

2 结果与分析

2.1 不定芽诱导

从表1可以看出，6-BA浓度对外植体芽诱导影响显著，6-BA浓度在培养基③即1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L时诱导率达到最大，为89.7%，且芽叶舒展有活力，呈绿色。当6-BA浓度为0～0.5 mg/L时，诱导率随着6-BA浓度的升高而升高，且在6-BA浓度为1.0 mg/L以上时出现丛生芽（图1）；当6-BA浓度为2.0～2.5 mg/L时，诱导率随着6-BA浓度的降低而降低，且在6-BA浓度为2.0 mg/L以上时出现玻璃化芽，对外植体诱导成芽不利。

2.2 增殖培养

从表2可以看出，培养基DCR+6-BA 0 mg/L+NAA 0 mg/L增殖率最低，仅为1.11倍；附加6-BA浓度在一定范围内（0～0.8 mg/L），芽点增殖率也显著增加，6-BA浓度升至0.8 mg/L时产生丛生芽增殖率最高，而随浓度继续升高（1.1 mg/L），增殖率反而下降，并出现畸形芽；同时附加低浓0.1 mg/L NAA能提高增殖率及瓶苗质量，附加0.2 mg/L的NAA，则诱导产生褐色愈伤组织，降低增殖率及瓶苗质量。

6-BA浓度、NAA浓度及其相互作用对台湾过山香增殖率均存在极显著影响（p

2.3 生根诱导

取芽枝长1.5～2.0 cm、生长健壮无污染的不定芽进行生根培养。从表3可以看出，生根率最高的为1/2MS+IBA 0.5 mg/L+ABT 1生根粉0.4 mg/L处理，生根率为95.26%，生根率最低的为1/2MS+IBA 0 mg/L+ABT 1生根粉0 mg/L处理，说明添加一定量的激素可以促进根系的生长，在不添加激素时无根系产生。IBA浓度在0.3～0.5 mg/L时，生根率随着浓度的升高而升高，且未产生愈伤组织，当浓度继续加大时，生根率反而降低，且产生愈伤组织，添加一定浓度的ABT 1生根粉后可以促进产生毛状须根。对瓶苗进行观察，1/2MS+IBA 0.5 mg/L+ABT 1生根粉0.4 mg/L处理的基部无愈伤组织产生，根系粗、有毛状须根产生，平均根数2.67条（图2）。

2.4 试管苗移栽

生根试管苗开盖炼苗2 d后，对台湾过山香生根瓶苗进行移栽，从表4可以看出，移栽基质对其移栽成活率存在极显著差异（p

3 结论与讨论

试验结果表明，6-BA浓度对外植体芽诱导具显著影响，可诱导外植体产生多芽，最佳诱导培养基为1/2 MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，诱导率可达89.7%。6-BA浓度、NAA浓度及其相互作用对台湾过山香增殖率均存在极显著影响，台湾过山香较适宜DCR培养基进行组织培养，且小芽舒展、叶绿色。最佳增殖培养基为DCR+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.1 mg/L，增殖率达5.24倍，继代周期为35 d。IBA浓度、ABT 1生根粉浓度及其交互作用明显，可显著提高台湾过山香试管苗生根率，提高试管苗发根数量；添加ABT能有效促使根毛形成，大大提高试管苗根系品质，有利于试管苗移栽成活。最佳生根培养基为1/2MS+IBA 0.5 mg/L+ABT 0.4 mg/L，生根率达95.26%。

移栽基质对其移栽成活率存在极显著差异，黄心土+钙镁磷肥能有效促进根系生长，缩短缓苗时间，最佳移栽基质为泥炭土∶黄心土∶珍珠岩∶钙镁磷肥（3.0∶2.0∶1.0∶0.2），移栽成活率达93.7%，且7 d缓苗，茎杆半木质化，茎叶浓绿，长势好[8]。

4 参考文献

[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志（第43卷第2分册）[M].北京：科学出版社，1997：126.

[2] 赵中振，萧培根.当代药用植物典（第2册）[M].北京：世界图书出版社，2007：136.

[3] 郑元春.过山香[J].园林，2011（7）：72-73.

[4] 李煌.过山香或其提取物的用途[P].中华人民共和国国家知识产权局.CN 103316120 A.2014.01.29.

[5] 张启春，韩翔.野生茅莓快繁体系的初步建立[J].北方园艺，2011（1）：141-144.

[6] 李永宏，黄清臻.新复极差法在生物统计中的应用[J].医学动物防制，2002，18（5）：270-272.

[7] 龚江，石培春.使用SPSS软件进行多因素方差分析[J].农业网络信息，2012（4）：31-33.

[8] 刘秀芳，林.黄花倒水莲（Polygala fallax Hemsl）组培快繁技术研究[J].种子，2012，31（2）：57-59，63.