石决明酶活力变化规律
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九孔鲍（Haliotis diversicolor aquatilis）味道鲜美，营养丰富，市场需求量大，经济价值高，为我国南方鲍养殖的主要品种之一，对于其繁殖生物学、胚胎及胚后发育、人工苗种培育及养成等方面已有较详细的研究［1－2］，而有关性腺发育过程中营养学和消化生理学方面的研究尚未见报道。性腺发育期对营养物质的需求远高于生长期［3－5］，而动物对营养物质的消化吸收主要取决于消化能力的大小。消化酶作为消化系统分泌的营消化作用的酶类，其种类、特性及活力在一定程度上可以反映动物的消化及营养生理状况，消化酶活力的高低直接影响九孔鲍对营养物质的消化能力，从而影响性腺的发育，进而影响成熟精卵的质量及幼体的存活率，最终影响苗种生产。贝类消化酶的研究多集中于消化酶种类、性质、幼体发育不同阶段酶活力的变化等方面［6－22］。有关繁殖期消化酶的研究很少，仅在甲壳动物，如中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）［23］和中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）［24］等有过相关报道，但迄今未见贝类性腺发育过程中消化酶的研究报道。笔者通过研究九孔鲍性腺不同发育阶段消化酶的活力变化，研究九孔鲍繁殖期对营养物质的消化能力，旨在探讨亲鲍的消化生理特性及其营养需求，从而为亲鲍促熟和人工育苗以及九孔鲍的消化生理学和营养学研究提供科学参考，并为繁殖期人工饵料的合理配制提供必要的理论参考依据。
1 材料与方法
1．1 试验材料
性腺不同发育阶段的九孔鲍于2010年5—6月购自 厦 门 林 阳 鲍 鱼 养 殖 场，体 质 量11～14g［（12．5±0．86）g］，壳长4．5～5．5cm［（5．2±0．38）cm］。雌、雄各20只，共40只。
1．2 样品制备
取性腺不同发育阶段的雌、雄九孔鲍，于冰盘中活体解剖，迅速取出肝胰腺和消化道，剔除附着物，用滤纸吸干各部位水分并称量质量，剪碎，各加入10倍体积（m／V）预冷双蒸水（4℃）；用高速匀浆机匀浆，匀浆液用高速冷冻离心机4℃4000r／min冷冻离心30min，取上清液（即粗酶液），用于测定蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶活力及蛋白含量（4℃保存，24h内测定完毕，或长期保存于－80 ℃低温冰箱）。同时取性腺进行组织学研究。
1．3 试验设计
根据肉眼观察及性腺组织学切片鉴别选取性腺发育不同阶段的雌、雄九孔鲍，参照姜永华等［25］的分期方法并略作调整，将九孔鲍性腺发育分为增殖期、生长期、成熟前期、成熟期和排放期共5期，由3只性腺发育同一阶段的九孔鲍的同一部位组织合成1个样品，每个样品设3个平行组，3个对照组，结果取平均值。用恒温水浴锅控温，各消化酶的反应pH采用0．2mol／L磷酸氢二钠－柠檬酸钠缓冲液配制。
1．4 酶活力测定
参照潘鲁青等［26］的方法，并作改进，用多功能酶标仪测定各消化酶的光密度值，根据标准曲线计算酶活力。酶活力用比活力（U／mg）表示。
1．4．1 蛋白酶活力测定
采用以1％酪蛋白为底物的福林－酚试剂显色法，以1μmol／mL酪氨酸溶液制做标准曲线。蛋白酶活力定义为：在37℃，pH 7．0条件下，单位粗酶液每分钟水解酪蛋白产生1μmol酪氨酸为一个活力单位。
1．4．2 淀粉酶活力测定
采用以2％可溶性淀粉为底物的3，5－二硝基水杨酸显色法，以1μmol／mL麦芽糖溶液制做标准曲线。淀粉酶活力定义为：在37 ℃，pH 7．2条件下，单位粗酶液每分钟水解淀粉产生1μmol麦芽糖为一个活力单位。
1．4．3 纤维素酶活力测定
采用以0．5％羧甲基纤维素钠为底物的3，5－二硝基水杨酸显色法，以1μmol／mL葡萄糖溶液制做标准曲线。纤维素酶活力定义为：在37 ℃，pH5．2条件下，单位粗酶液每分钟水解纤维素产生1μmol葡萄糖为一个活力单位。
1．5 蛋白含量测定
采用考马斯亮蓝G－250染色法［27］，以0．1mg／mL小牛血清蛋白溶液为标准物，测定单位粗酶液的蛋白含量（mg）。
1．6 数据分析与整理
试验数据采用SPSS 13．0统计软件进行单因素方差分析和LSD多重比较，检验各试验组间数据的差异显著性，显著性水平设计为P ＝0．05，P＞0．05表示差异不显著，P＜0．05表示差异显著，P＜0．01表示差异极显著。所有数据均以平均值±标准差（n＝3）表示。
2 结果与分析
2．1 性腺发育过程中蛋白酶活力变化及器官差异
2．1．1 精巢发育过程中蛋白酶活力的变化及器官差异
九孔鲍蛋白酶活力随着精巢的发育而发生的变化及同一发育期不同器官内的差异见表1。由表1可知，九孔鲍肝胰腺和消化道中蛋白酶活力均随精巢的发育呈先升后降的峰值变化，且均在成熟前期达到最高值，显著高于其他发育期（P＜0．01）。从增殖期至排放期，成熟前期和成熟期肝胰腺中蛋白酶活力显著高于消化道中（P＜0．05），其余各期则无显著差异（P ＞0．05）。2．1．2 卵巢发育过程中蛋白酶活力的变化及器官差异九孔鲍肝胰腺和消化道内蛋白酶活力随着卵巢的发育也呈现先升后降的变化趋势，且均在成熟前期达到最高值（P＜0．01）。除成熟期和排放期（P＜0．05）外，其余各期肝胰腺和消化道内蛋白酶的活力差异不显著（P＞0．05）（表2）。2．2 性腺发育过程中淀粉酶活力变化及器官差异2．2．1 精巢发育过程中淀粉酶活力的变化及器官差异九孔鲍肝胰腺和消化道内的淀粉酶活力均随精巢的发育先升后降，且在成熟期达到最高值（P＜0．01）（表3）。由表3可见，肝胰腺中淀粉酶活力在各发育期均显著高于消化道中淀粉酶活力（P＜0．01），表明九孔鲍肝胰腺对淀粉的消化能力远比消化道高。
2．2．2 卵巢发育过程中淀粉酶活力的变化及器官差异
卵巢不同发育阶段九孔鲍淀粉酶活力变化情况及不同器官中的差异见表4。总体上肝胰腺和消化道中淀粉酶的活力都随卵巢的发育先升后降，也均在成熟前期达到最高值（P＜0．01）。在各发育期内，肝胰腺中淀粉酶活力均显著高于消化道中的淀粉酶活力（P＜0．01），表明九孔鲍消化淀粉的主要器官是肝胰腺。
2．3 性腺发育过程中纤维素酶活力的变化及器官差异
2．3．1 精巢发育过程中纤维素酶活力的变化及器官差异
九孔鲍肝胰腺和消化道内纤维素酶活力随着精巢的发育而发生变化的结果见表5。在各发育期内，九孔鲍肝胰腺和消化道中纤维素酶活力均呈现先升后降的峰值变化，且均在成熟前期时最高（P＜0．01）。此外，各发育期内的纤维素酶活力均表现为肝胰 腺 显 著 高 于 消 化 道 纤 维 素 酶 活 力 （P＜0．01），表明九孔鲍肝胰腺消化纤维素的能力远高于消化道。
2．3．2 卵巢发育过程中纤维素酶活力的变化及器官差异
在各发育期内，九孔鲍肝胰腺和消化道内纤维素酶活力也随着卵巢的发育呈现先升后降的变化趋势，均在成熟前期达到峰值（P＜0．01）（表6）。由表6可见，在各发育期内，肝胰腺中纤维素酶活力均显著高于消化道中纤维素酶活力（P＜0．01），表明九孔鲍肝胰腺是消化纤维素的主要器官。
2．4 性腺发育过程中九孔鲍各消化酶活力的分布
2．4．1 性腺发育过程中蛋白酶活力分布的雌、雄差异
各性腺发育期内雌、雄九孔鲍肝胰腺和消化道中蛋白酶活力的差异见表7。在肝胰腺中，雌鲍蛋白酶活力在增殖期、生长期和排放期显著高于雄鲍（P＜0．05），成熟前期和成熟期雌、雄九孔鲍无差异（P＞0．05），表明在性腺发育早晚期雌鲍肝胰腺消化蛋白质的能力更强。在消化道中，除增殖期（P＞0．05）外，蛋白酶活力均表现为雌鲍显著高于雄鲍（P＜0．05），表明雌鲍消化道对蛋白质的消化能力高于雄鲍。
2．4．2 性腺发育过程中雌、雄九孔鲍淀粉酶活力分布的差异
从生长期至成熟期，雌鲍肝胰腺中淀粉酶活力显著高于雄鲍（P＜0．01）（表8），表明在繁殖期雌鲍肝胰腺对淀粉的消化能力远高于雄鲍。在消化道中，成熟前期和成熟期雌鲍淀粉酶活力显著高于雄鲍（P＜0．05），增殖期、生长期和排放期雌、雄鲍的淀粉酶活力差异不显著（P＞0．05），表明在性腺发育中期雌鲍消化道对淀粉的消化能力比雄鲍高，而性腺发育早、晚期消化道内淀粉酶的活力分布雌、雄九孔鲍无差异。
2．4．3 性腺发育过程中纤维素酶活力分布的雌、雄差异
在成熟前期及成熟期内，雌鲍肝胰腺中纤维素酶活力显著高于雄鲍（P＜0．01）（表9），表明在性腺发育中期雌鲍肝胰腺消化纤维素的能力更强。消化道中纤维素酶活力均表现为雌鲍显著高于雄鲍（P＜0．01），表明雌鲍消化道对纤维素的消化能力远高于雄鲍。
2．4．4 性腺发育过程中各消化酶最大活力分布的器官差异
雌、雄九孔鲍各消化器官内各消化酶最大活力的分布见表10。由表10可见，雌、雄鲍肝胰腺和消化道内均以纤维素酶活力最高（P＜0．01），淀粉酶活力次之（P＜0．01），蛋白酶活力最低（P＜0．01）。其中，雄鲍肝胰腺中纤维素酶活力约为淀粉酶活力的1．5倍，蛋白酶活力的4．7倍；雄鲍消化道中纤维素酶活力约为淀粉酶活力的1．9倍，蛋白酶活力的4．0倍；雌鲍肝胰腺中纤维素酶活力约为淀粉酶活力的1．7倍，蛋白酶活力的7．8倍；雌鲍消化道中纤维素酶活力约为淀粉酶活力的1．8倍，蛋白酶活力的4．3倍。由表10还可看出，同一种消化酶在不同器官内的最大活力分布也有显著差异。除雌鲍蛋白酶外（P＞0．05），雌、雄鲍3种消化酶在肝胰腺和消化道内的分布均有显著的器官特异性，均为肝胰腺＞消化道（P＜0．01）。
3 讨论
3．1 九孔鲍性腺发育过程中消化酶活力的变化
性腺发育过程也是一个营养物质和能量积累和储存的过程［3，24，28］，尤其是卵巢中卵黄的积累快速而大量［25］，这是保证精卵质量、胚胎正常发育及提高幼体存活率的物质基础［29］。要完成营养物质的快速积累，必然要有相应的高效消化吸收机制作保证，其中消化酶活力是重要的保证机制之一。本研究结果表明，雌、雄九孔鲍各消化酶活力均随着性腺发育呈现出先升后降的变化趋势，其中在性腺发育早期和晚期酶活力较低，在性腺发育中期（即营养物质快速积累期［25］）酶活力显著升高，且均在成熟前期达到最高值，卵巢中各消化酶活力的变化尤其显著。究其原因，可能与卵黄的合成密切相关①，因为九孔鲍卵巢发育早期卵黄合成以内源性为主，无需外源营养供应，故消化酶活力与正常生长时的水平相近；而卵巢发育中期是外源性卵黄大量合成的阶段，需要通过血淋巴从卵外获取大量营养物质，故各消化酶活力均显著上升；卵巢发育晚期，卵黄合成基本结束，对外源营养物质的需求也大幅减少，故消化酶活力迅速降低。中华绒螯蟹［23］卵巢发育过程中肝胰腺消化酶活力的变化趋势与九孔鲍类似。吴垠等［24］也报道中国明对虾蛋白酶在卵巢成熟的Ⅳ期前活性较高，临产卵时（V期）活性明显下降。Fernandez等［30］认为红对虾（Penae－us notialis）在性腺发育过程中消化酶活性较高可能与卵巢发育和该时期新陈代谢活动水平有关。许多研究表明，繁殖期的消化酶活力高于正常生长期［3－5］，九孔鲍也有类似的现象。在九孔鲍性腺发育过程中，除蛋白酶外，淀粉酶和纤维素酶活力均显著高于生长期②，表明九孔鲍消化酶活力会随着发育阶段的变化而变化。可能是因为生长期主要满足机体生长的营养需求即可，而繁殖期除满足正常生长外，还要满足性腺发育的营养需求，故消化酶活力显著高于生长期。九孔鲍亲鲍的消化生理调控机制及其与性腺发育的关系有待进一步深入研究。
3．2 九孔鲍繁殖期消化酶活力的分布
九孔鲍繁殖期各消化酶的活力分布存在器官特异性。除蛋白酶外，雌、雄九孔鲍的淀粉酶和纤维素酶活力在各性腺发育期均表现为肝胰腺＞消化道，说明肝胰腺是九孔鲍淀粉酶和纤维素酶合成、分泌的主要场所，是淀粉和纤维素的主要消化器官。这与肝胰腺是蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等酶类的中心生成器官的结论一致［31］。雌、雄九孔鲍蛋白酶活力除在成熟期有显著的器官差异外，在其余各性腺发育期肝胰腺和消化道中差异不显著，表明在繁殖期肝胰腺和消化道对蛋白质的消化能力基本一致。李太武等［13］报道皱纹盘鲍（Haliotis dis－cus hannai）消化酶活力均为肝胰腺＞消化道，与本研究结果有所不同，这可能与种类、发育阶段、食性、栖息环境等有关。九孔鲍繁殖期各消化酶活力分布还存在性别差异。在各性腺发育期，各消化酶活力在肝胰腺和消化道中均表现为雌鲍高于雄鲍，尤其在性腺发育中期。这种雌雄差异意味着在繁殖期雌鲍对营养物质的消化能力更强。究其原因，可能与精卵发生的差异有关。因为卵子发生是卵黄大量形成积累的过程，需要大量营养物质的摄入，因而需要高效的消化吸收机制作保证；而发生主要是遗传物质的携带保护过程，无需大量营养物质的供应，故繁殖期雌性九孔鲍中的消化酶活力才显著高于雄性个体。周永奎等［23］也指出，卵巢发育过程中中华绒螯蟹肝胰腺消化酶活力显著升高。同种消化器官内各消化酶的活力也存在差异。雌、雄九孔鲍繁殖期肝胰腺和消化道内各消化酶的最大活力均为：纤维素酶＞淀粉酶＞蛋白酶，表明九孔鲍在性腺发育期具有很强的消化纤维素和淀粉的能力，而对蛋白质的消化能力弱。本研究结果与杂色鲍（Haliotis diversicolor diversicolor）［16］相符，与皱纹盘鲍［13］肝脏中的结果一致，而与皱纹盘鲍［13］消化道中及缢蛏（Sinonovacula constricta）［8］有显著不同。
3．3 九孔鲍消化酶活力与食性的关系
动物的消化酶组成具有种的特异性，且与其食性密切相关。花缘牡蛎（Ostrea circumpicta）和欧洲牡蛎（O．edulis）［32］消化盲囊中的消化酶主要为糖类水解酶、蛋白酶和脂肪酶；缢蛏［8］胃和消化盲囊中具有淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶活力。本研究结果表明，九孔鲍的消化酶以糖酶（淀粉酶和纤维素酶）为主，蛋白酶活力低，脂肪酶近乎无。关于纤维素酶的来源尚存争议［33］，究竟是动物自身分泌的还是肠道细菌产生的，看法不一。九孔鲍中纤维素酶活力最高，其来源究竟如何，尚待进一步进行生化研究予以确定。
刘万顺等［34］认为，不同生物体内同一功能酶的活力与动物的遗传性及食性有关。缢蛏［8］的主要饵料为浮游性弱而易于下沉的底栖硅藻，其淀粉和蛋白质含量较高，缺少纤维素成分，故缢蛏淀粉酶和蛋白酶活力较高，纤维素酶活力极低；而九孔鲍主要 摄 食 富 含 纤 维 素 和 淀 粉 的 江 蓠 （Gracilaialemaneiformis）等大型藻类［1－2］，蛋白质含量低，几乎不含脂肪，故其纤维素酶和淀粉酶的活力高，蛋白酶活力低，检测不到脂肪酶。因此在九孔鲍繁殖期，饵料供应应根据其消化酶活力变化规律，雌、雄分开，适时适量，应以纤维素为主，淀粉类次之，蛋白质少量。这样才能够充分发挥九孔鲍亲鲍的消化功能，促进其性腺的快速健康发育，为后续的苗种培育奠定良好的种质基础。