蝴蝶兰种胚快繁技术研究

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摘要　本试验以盆栽蝴蝶兰‘火鸟’为材料，采用常规杂交方法获取果荚。果荚采后进行消毒处理，采用不同培养基对种子胚进行无菌播种试验，筛选最佳种子胚播种培养基。结果表明：果荚采摘最佳时间为授粉后120d。采用75％酒精30s和0.1％升汞6min的消毒处理污染率最低，花宝1号2.0g／L+蛋白胨2.0g／L+肌醇0.1g／L+磷酸三钙0.1g／L+香蕉汁100g／L+蔗糖20g／L+琼脂7.0g／L是蝴蝶兰无菌播种的最佳培养基。

关键词　蝴蝶兰；种胚；组织培养

蝴蝶兰为兰科多年生附生草本，又名蝶兰，是兰科植物中栽培最为广泛的种类之一，主要分布在热带及亚热带地区。其花形奇特，色彩艳丽，花期持久。素有“兰中皇后”的美誉。具有极高的观赏和经济价值，在国内外花卉市场上极受欢迎。蝴蝶兰为单轴兰花，植株上极少发育侧枝，很难采用常规分株法进行大量的无性繁殖，而且其种子不含为胚萌发提供营养的胚乳或其他组织。在自然条件下萌发率极低，难以利用一般的种子播种方式进行有性繁殖，而且比其他种类的兰花更难于进行常规无性繁殖，组织培养是建立蝴蝶兰快速繁殖无性系的重要手段。目前应用最多的繁殖方法为无菌播种，一般品种授粉后，一个果荚约含有几万个种子，播种后可在短时间内获得大量蝴蝶兰小苗，成本相对较低。蝴蝶兰采用组织培养方法进行种苗繁殖，具有增殖率高、速度快、不受季节限制、可周年生产及容易去除病毒等优点，是大规模种苗生产的唯一途径。

材料与方法

供试材料

供试材料为河南省济源市农业科学研究所栽培的蝴蝶兰品种‘火鸟’。

试验方法

杂交获取果荚

人工授粉时，首先要选择好亲本，一般情况下，开花第1天花粉发芽力最强，开花7天后花粉仍可应用，雌花最好的授粉时间是开花3天～4天。授粉时先将母本的花粉块除去，再将父本的花粉块用小镊子镊起，轻轻地放在母本的柱头上，因柱头和花粉块上都有粘液，花粉在柱头上粘得牢，不必担心花粉块脱落。授粉后不需要套袋，用铅笔写好标牌，挂在授粉母株上。晴天气温较高时，授粉后结实率可达95％以上。

外植体消毒

果实采收后，用流动水冲洗干净，移到超净工作台上，放在超净工作台上无菌条件下，用75％酒精侵泡30s；再放入0.1％的升汞溶液中分别侵泡3min、4min、5min、6min，然后用无菌水冲洗5次～6次，将果实放在无菌纸上，用手术刀剖开果实取出粉状种子胚，将种子胚均匀地播种到无菌播种培养基上，培养温度为(25±1)℃，光强1500Lx～2000Lx。15天后调查各自污染率及褐化率(见表1)，选取最佳外植体消毒时间。

无菌播种

在超净工作台上，用无菌手术刀将果荚前后端各切下1cm，中间段纵切，用镊子将内部肉眼几乎看不见的种子刮下放入加有无菌水的培养皿中，使种子散到水中，然后用专门的移液器将浮在无菌水表面的种子和水一起吸取，铺入不同的种子萌发培养基上，晃匀即可。40天后观累种子胚在不同培养基上的生长情况，筛选出蝴蝶兰‘火鸟’种子胚最佳播种培养基。

不同激素浓度培养基

采用不同激素浓度培养基(见表2)，筛选出无菌播种培养基。

结果与分析

杂交果实的采收

在杂交后120天，蝴蝶兰‘火鸟’果实变为黄绿色，及时采收果实。采收的果实长约10cm，直径约1.2cm，授粉结实率92.5％。蝴蝶兰果实为蒴果，成熟时应及时采收，否则易裂果(图1)。

0.1％升汞溶液不同浸泡时间对外植体污染率的影响

外植体在培养基上接种20天后，陆续开始有污染出现。统计外植体消毒过程中0.1％升汞溶液浸泡不同时间各处理在接种后1个月内的污染率，结果如下

从表1可看出，0.1％升汞溶液浸泡3min或4min消毒时间不够，污染率较高，5min或6min差异不明显，污染率为分别为16％和15％。因此，以蝴蝶兰果荚作为外植体，消毒时间不能少于5min，而就此试验中，在75％酒精侵泡30s，0.1％升汞溶液浸泡6min处理污染率最佳。

不同培养基对蝴蝶兰‘火鸟’无菌播种后生长情况的影响

采用7种不同培养基(表2)对蝴蝶兰‘火鸟’种子胚进行无菌播种对比试验，各处理均在温度(25±1)℃，光照度1500Lx～2000Lx，每天光照12h的条件下培养，40天后观察记载结果见表3。

从表3中可看出：3号培养基发芽率最高，生长速度最快，1、4、7号培养基的播种苗的胚黄色，部分褐色死亡，5、6号培养基的播种苗原球体为黄绿色，但萌发率不高，胚的颜色以2、3号培养基较好，综合评判以3号培养基为佳。从7种不同培养基的培养效果可以看出，适量的花宝1号和香蕉汁对蝴蝶兰‘火鸟’种子萌发及生长有较好的促进作用，蝴蝶兰‘火鸟’种子胚无菌播种的最佳培养基为花宝1号2.0g／L+蛋白胨2.0g／L+肌醇0.1g／L+磷酸三钙0.1g／L+香蕉汁100g／L+蔗糖20g／L+琼脂7.0g／L。

小结与讨论

蝴蝶兰在人工授粉时，开花第1天花粉发芽力最强，开花7天后花粉仍可应用，雌花最好的授粉时间是开花3天4天。要选择在晴天气温较高时，授粉的结实率可达95％以上。在杂交后120天，当蝴蝶兰果实呈黄绿色时，及时采收，否则易裂果。

植物组织培养的成功，除选择适宜的培养基之外，外植体的消毒处理很重要。蝴蝶兰‘火鸟’果荚表面消毒效果试验表明，在0.1％升汞消毒时间低于5min的情况下，污染率高达40％以上，消毒时间为5min、6min条件下污染率较低，分别为16％和15％。

不同的培养基对蝴蝶兰‘火鸟’种子胚的生长萌发有较大影响，在不适合的培养基上种子胚萌发少，生长速度慢，有些即使萌发，生长一段时间以后也渐渐枯黄，萌发后枯死的原因有待进一步研究。本试验用了7种不同培养基进行试验，结果发现，蝴蝶兰‘火鸟’种子胚在加入适量花宝1号和香蕉汁的培养基上表现较好，最佳培养基为花宝1号2.0g／L+蛋白胨2.0g／L+肌醇0.1g／L+磷酸三钙0.1g／L+香蕉汁100g／L+蔗糖20g／L+琼脂7.0g／L。